丁苯酞預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后HSP70與TLR4表達的影響

摘要：目的觀察熱休克蛋白（HSP70）與Toll樣受體4（TLR4）在局灶性腦缺血再灌注中的表達規律及丁苯酞（NBP）預處理對其表達規律的影響，探討NBP預處理防治腦缺血的作用。方法72只成年雄性Wistar大鼠隨機分為假手術對照組、NBP預處理組（缺血再灌注組），根據再灌注時間不同分為再灌注6 h、12 h、24 h、48 h亞組。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶缺血再灌注模型，HE染色觀察腦組織形態病理學變化；采用DNA原位末端缺口標記法（TUNEL）檢測神經元凋亡；免疫組化法測定大鼠腦缺血再灌注不同時間HSP70與TLR4的平均灰度值。結果與假手術組比較，缺血再灌注組HSP70在缺血再灌注6 h明顯升高，于24 h達到峰值（P<0.05），TLR4在缺血再灌注6 h時表達較高，隨灌注時間延長表達逐漸增高（P<0.05）；NBP預處理組HSP70與TLR4陽性表達在各時間點明顯增加但低于手術組（P<0.05）。結論NBP預處理可降低腦缺血再灌注損傷大鼠TLR4及其內源性配體HSP70的表達，有效防治腦缺血再灌注損傷。

關鍵詞：丁苯酞 腦缺血再灌注損傷 熱休克蛋白70 Toll樣受體4 凋亡 炎癥反應

中圖分類號：R743.31文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0572-02

熱休克蛋白（HSP70）對壞死和凋亡都有抑制作用^［1］，而其作為內源性配體又可激活Toll樣受體4（Toll like recptor4，TLR4），內源性配體激活TLR4可能是缺血再灌注損傷中最主要的炎癥應答的觸發器^［2］。丁苯酞能夠在多個病理環節有效治療急性腦缺血性損傷^［3］。本實驗旨在研究丁苯酞（NBP）預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時間點HSP70與TLR4表達的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的防治。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器72只健康成年雄性Wistar大鼠，體重（230±10）g，山西醫科大學生理實驗室。丁苯酞(石藥集團恩必普藥業有限公司，批號:10010411)。兔抗鼠HSP70單克隆抗體、兔抗鼠TLR4單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均為北京博奧森生物技術有限公司，10%水合氯醛、4%多聚甲醛、25%烏拉坦、PM-10AD光學顯微鏡（Olympus optical Co.Ltd，JAPAN）、BI-2000醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司，由山西醫科大學生理教研室提供）。

1.2動物分組、模型制備與給藥72只健康雄性Wistar大鼠隨機分為：假手術組，NBP預處理組，局灶腦缺血1 h后再灌注組。每組又分為再灌注后6 h，12 h，24 h，48 h，每個時間點6只。NBP預處理組在缺血前3 d每天按體重經腹腔注射NBP80 mg/kg，假手術組與缺血再灌注組予以等體積生理鹽水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，參照Zea longa線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，缺血1 h后實施再灌注。假手術組插入深度為8 mm，其余操作同缺血再灌注組。實驗過程中和動物蘇醒期間保持動物體溫在(37±0.5) ℃，直至動物蘇醒，予以神經功能評分。以大鼠手術麻醉清醒后神經功能缺陷評分在1分～3分，無蛛網膜下隙出血動物進行實驗。0分、4分或死亡剔除，再隨機補充。

1.3標本制備各組大鼠在規定時間點腹腔內注射25%烏拉坦4 mL/kg麻醉。結扎腹主動脈，開胸，經左心室灌注生理鹽水100 mL沖凈血液灌注4 ℃ 4%多聚甲醛200 mL。開顱取腦，置于10%中性甲醛溶液中保存24 h~48 h。取視交叉前后2 mm的大腦組織，固定脫水，石蠟包埋，連續切片，片厚2 μm，60 ℃烤片2 h~4 h備用。每個腦組織共取片4套，分別進行HE染色，TUNEL，HSP70與TLR4免疫組化染色。

1.4指標檢測

1.4.1HE染色觀察腦組織切片常規脫蠟，HE染色，封片，光鏡下觀察。

1.4.2免疫組織化學染色采用SP法切片依次脫蠟，3%過氧化氫孵育15 min，PBS洗5 min×3次；高壓抗原修復2.0 min；分別滴加1∶150的HSP70抗體與TLR4抗體，加入4 ℃冰箱過夜或37 ℃溫箱孵育2 h；PBS洗5 min×3次；滴加二抗工作液，37 ℃溫箱孵育30 min；PBS洗3 min×3次，DAB顯色、脫水、復染、封片。每張切片于400倍光鏡下隨機檢測缺血側海馬CA1區5個不重復視野HSP70與TLR4表達情況，分別計算HSP70與TLR4染色陽性細胞平均灰度值。

1.4.3TUNEL法檢測凋亡每張切片于250倍光鏡下隨機計數缺血側海馬CA1區5個不重復視野陽性細胞數（胞核呈棕黃色顆粒），計算平均值。

1.5統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，行單因素方差分析ANOVA。

2結果

2.1HE染色假手術組缺血側腦組織HE染色著色較深，細胞密度大，形態和結構無異常。缺血再灌注組腦組織梗死灶位于右側額頂葉皮質和紋狀體區，結構疏松成片狀分布，可見間質水腫，有散在空腔。缺血中心區灶性細胞腫脹，溶解等壞死特征，梗死灶周圍出現部分細胞核固縮濃染，核仁模糊或消失，細胞間質染色淺而不均勻偶見凋亡小體；隨再灌注時間延長梗死灶周圍具有凋亡性細胞形態的細胞神經細胞增多。缺血中心區和正常腦組織之間有一過渡區，細胞數量減少，部分胞體縮小，為缺血半暗區。NBP預處理組病理改變輕微，較少見神經元變性壞死。

2.2TUNEL檢測結果缺血再灌注組對側及假手術組大腦半球偶見凋亡細胞，推測系生理性壞死的神經元；缺血再灌注組缺血半暗帶區可見大量凋亡細胞（P<0.05）；NBP預處理組凋亡細胞數明顯減少，但高于假手術組（P<0.05）。詳見表1。

2.3HSP70與TLR4免疫組織化學結果假手術組存在少量HSP70與TLR4表達，缺血再灌注組海馬CA1區HSP70與TLR4顯著升高，NBP預處理組HSP70升高，但低于缺血再灌注組（P<0.05），TLR4逐漸升高，但各時間點均低于缺血再灌注組。詳見表2、表3。3討論

HSP70在胞漿中與變性蛋白結合維持蛋白自身穩定性，進入胞核與核糖體前體及其他核內蛋白結合防止其變性引起細胞生命信息紊亂。TLR4是天然免疫系統的一種模式識別受體，介導機體的天然免疫，而HSP70作為內源性配體可激活TLR4^［4］，信號通過兩條途徑由胞外向胞內級聯傳遞：My D88依賴途徑和My D88非依賴途徑，前者直接誘導炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的產生，后者依賴IFN調節因子3(IFN regulatory factor 3，IRF-3)的活化，誘導IFN-β和IFNα誘導基因(如IP-10)的生成，從而引起眾多炎癥因子表達。自1998年Poltorak等發現TLR4以來，其作為炎癥跨膜受體在非生物性炎癥損傷中起重要作用^［5］。炎癥反應參與了腦缺血再灌注損傷^［6］。

丁苯酞可阻斷腦卒中所致腦損傷的多個環節，具有較強的抗缺血作用。NBP預處理在防治腦缺血再灌注損傷的作用國內外鮮有報道。本實驗研究發現，假手術組HSP70與TLR4表達較少，且各時間點無統計學意義。在缺血再灌注組HSP70于再灌注6 h表達增多，隨時間延長表達逐漸升高，于再灌注24 h達到峰值。而TLR4于再灌注6 h就有較高表達，隨時間延長表答逐漸增高，提示TLR4參與了腦缺血再灌注損傷的發展。與缺血再灌注組比較，NBP預處理組各時間點HSP70與TLR4表達較低，但均高于假手術組。本實驗還發現，隨再灌注時間延長，TLR4與HSP70各自表達高峰時間不一致，不排除腦梗死時缺血缺氧所促發的血管內皮通透性改變，腦組織壞死物質釋放，吸引外源性的單核巨噬細胞、淋巴細胞趨化聚集，成為加劇炎性損傷的效應細胞，這些細胞均有豐富的TLR4表達，且HSP70被TLR4識別后可能增強了TLR4的表達，從而加重腦缺血再灌注損傷的發展。

NBP預處理可能通過抑制TLR4及內源性配體的表達來發揮防治腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡及非生物性炎癥損傷。目前國內外把丁苯酞作為治療缺血性腦卒中，但對其預防腦缺血再灌注損傷的機制尚需進一步研究。

參考文獻：

［1］Sun Y，Ouyang YB，Xu L，et al.The carboxyl-terminal domain of inducible HSP70 protects from ischemic injury in vivo and in vitro［Ｊ］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26:937-950.

［2］Javier R，Caso，Jesus M，et al.Toll-like receptor 4 is involved in brain damage and inflammation after experimental stroke［Ｊ］.J Stroke，2007，3:1599-1608.

［3］崔麗英，李舜偉，呂傳真，等.恩必普軟膠囊治療中度急性缺血性卒中的多中心開放臨床研究［Ｊ］ .中國腦血管病雜志，2005，2(3):112-115.

［4］Jianlin G，Bangmin Z，Ayesha M，et al.T cell activation by hert shock protein 70 vaccine requires TLR signaling and scavenger receptor expressed by endothelial cells-1［Ｊ］.JImmunology，2009，183:3092-3098.

［5］Marsh BJ，Williams-Karnesky RL，Stenzel-PooreMP，et al.Loll-like recptor signaling in endogenous neuroprotection and stroke［Ｊ］.J Neuroscience，2009，158:1007-1020.

［6］Jasna K.Melanie Lalancette-Hebert:Inflammation，plasticity and real-time imaging after cerebral ischemia［Ｊ］.J ActaNeuropathol，2009，117:497-509.

作者簡介:任建宏（1980—），男，畢業于長治醫學院，現為山西醫科大學2008級在讀研究生（郵編030001）;劉瑞珍（通訊作者），工作于山西醫科大學第二醫院（郵編030001）。

(收稿日期：2010-12-13)

(本文編輯王雅潔）