PM_2.5不同成分致冠脈粥樣硬化大鼠ACS的可能機制

摘要:目的從炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激兩方面來探討PM_2.5的水溶性及酸溶性成分致冠脈粥樣硬化大鼠ACS的可能機制。方法48只Wistar大鼠隨機分為兩組，對照組和冠脈粥樣硬化模型組，每組24只。提取PM_2.5水溶性成分（WSC）及酸溶性成分（ASC）。將對照組和模型組再各自隨機分為3組，正常對照組、WSC對照組、ASC對照組，以及模型對照組、WSC模型組、ASC模型組，每組8只。WSC組通過尾靜脈注射的方式給予WSC（40 mg/kg）染毒；ASC組給予ASC（40 mg/kg）染毒。染毒24 h后處死大鼠，測定血清中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細胞介素-6 （IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量及心肌中的NF-κB活性。結(jié)果WSC組TNF-α水平（2.83±0.97） ng/mL，高于空白組（2.53±0.76） ng/mL;心肌NF-κB的活化程度為（14.56±10.58）%，高于空白組（7.33±3.97）%。ASC組MDA水平（8.27±2.70） nmol/mL，高于空白組（7.24±0.66） nmol/mL；SOD水平（118.56±8.92）U/mL，低于空白組（130.38±5.69） U/mL；心肌NF-κB的活化程度（18.80±17.04）%，高于空白組（7.33±3.97）%。結(jié)論WSC具有升高TNF-α水平，激活心肌NF-κB的作用；ASC具有升高MDA、降低SOD水平，激活心肌NF-κB的作用。PM_2.5致冠脈粥樣硬化大鼠ACS發(fā)生的機制可能與其水溶性成分可加劇模型大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，而酸溶性成分在加劇炎癥反應(yīng)的同時，還表現(xiàn)出氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。

關(guān)鍵詞:PM_2.5 PM_2.5的水溶性成分 PM_2.5的酸溶性成分 冠脈粥樣硬化 氧化應(yīng)激 炎癥反應(yīng)

中圖分類號：R541.4文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0566-03

大氣顆粒物（particulate matter，PM）是對懸浮在大氣中固體和液體顆粒物的總稱，其中空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物稱為PM_2.5^［1-3］。由于PM_2.5粒徑較小，可直接進入肺泡并沉積，并可通過肺泡進入血液，而且大部分有害元素和化合物都富集于PM_2.5上，因而對人體健康造成的危害更大^{［1，4-6］}，目前正逐漸引起學(xué)者的重視，受到普遍關(guān)注。大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，空氣中PM_2.5濃度增高與心肺疾病的超額發(fā)病率、死亡率相關(guān)^［7-9］。美國國家環(huán)保局（EPA）進行的兩項前瞻性隊列研究表明，總死亡率及心肺疾病死亡率的上升與大氣中PM_2.5濃度增高相關(guān)^{［10，11］}。還有研究表明^［12］，急性心肌梗死（AMI）前2 h與24 h內(nèi)大氣顆粒物污染程度與AMI發(fā)病明顯正相關(guān)；發(fā)病前2 h PM_2.5每增加25 μg/m³，AMI發(fā)生危險增加48%，發(fā)病前24 h PM_2.5每增加20 μg/m³，AMI發(fā)生危險增加69%，提示PM_2.5對心血管系統(tǒng)具有潛在毒性。本實驗在建立冠脈粥樣硬化大鼠模型的基礎(chǔ)上，提取PM_2.5的水溶性及酸溶性成分，分別染毒模型及正常大鼠，通過對一些易損斑塊標志物的檢測，來探討PM_2.5不同成分致冠脈粥樣硬化大鼠ASC的可能機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑雄性Wistar大鼠，PM_2.5樣品來源于美國國家標準技術(shù)研究院，標號﹟2783，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所第一分所），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）放射免疫試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所），NF-κB p65單克隆抗體（Santa Cruze公司）。

1.2動物模型的建造48只健康雄性Wistar大鼠，體重180 g~220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為兩組，對照組和冠狀動脈粥樣硬化模型組（模型組），每組24只。模型組飼喂高膽固醇飼料，并在飼養(yǎng)開始時，腹腔注射V_D3 2 mL/kg（60 IU/kg）。對照組飼喂普通飼料，并在飼養(yǎng)開始時，腹腔注射生理鹽水2 mL/kg。12周后模型建成。

1.3PM_2.5不同成分的提取將400 mg PM_2.5溶于10 mL雙蒸水中，室溫下攪拌溶解60 min，再超聲震蕩3次，離心，經(jīng)三層濾紙過濾，所得濾液即為PM_2.5水溶性成分（WSC），其終濃度為40 mg/mL，4 ℃貯存?zhèn)溆谩SC提取過程中離心后所留沉淀物置于70 ℃干燥箱24 h，使其充分干燥，再將干燥物用10 mL濃度為1 mol/L的HCl溶解，所得濾液即為PM_2.5酸溶性成分（ASC），其終濃度為40 mg/mL，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4染毒及分組以尾靜脈注射的方式進行染毒。將飼喂12周后的對照組和模型組再各自隨機分為3組，分別為正常對照組、WSC對照組、ASC對照組，以及模型對照組、WSC模型組、ASC模型組，每組8只。WSC組給予WSC（40 mg/kg）染毒，ASC組給予ASC（40 mg/kg）染毒，空白組則以尾靜脈注射生理鹽水進行對照。染毒24 h后，處死大鼠，留取血清和心肌組織待測。

1.5指標測定MDA、SOD采用化學(xué)法測定；IL-6、TNF-α采用放射免疫法測定；NF-κB采用免疫組織化學(xué)法測定。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0。析因設(shè)計分析各因素的作用以及是否存在交互作用，而各組之間比較則采用析因設(shè)計的Bonferroni檢驗。

2結(jié)果

2.1各組MDA比較染毒因素、模型因素對MDA均沒有顯著影響，而且兩者之間也不存在交互作用。 ASC及AS模型對MDA均有升高作用。詳見表1、表2。

2.2各組SOD比較染毒因素對SOD具有顯著影響，模型因素對SOD無顯著影響，而且兩者之間也不存在交互作用。ASC有降低SOD的作用。詳見表3、表4。

2.3各組IL-6比較模型因素對IL-6具有顯著影響，染毒因素對IL-6雖無顯著影響，但卻與模型因素存在顯著的交互作用，各影響因素對IL-6總變異的貢獻依次為：兩因素的交互作用＞模型因素。各組之間的方差分析結(jié)果顯示，模型組高于對照組。AS模型可升高IL-6；而且染毒因素與模型因素還存在一定的交互作用，表現(xiàn)在AS模型與WSC、ASC對于IL-6的升高具有協(xié)同作用。詳見表5、表6。

2.4各組TNF-α的比較染毒因素、模型因素對TNF-α均有顯著影響，而兩者之間的交互作用并不顯著；兩因素對TNF-α總變異的貢獻分別為：模型因素＞染毒因素。各組之間的方差分析結(jié)果顯示，模型組高于對照組；WSC組高于空白組。WSC及AS模型對TNF-α均有升高作用。詳見表7、表8。

2.5各組NF-κB免疫組化檢測正常對照組可見藍染的胞核，并有黃色顆粒物分布于胞漿。染毒因素、模型因素對NF-κB核易位率均有顯著影響，而且兩者之間還存在有顯著的交互作用；三者對NF-κB核易位率總變異的貢獻依次為：模型因素＞染毒因素＞兩因素的交互作用。各組之間的方差分析結(jié)果顯示：ASC、WSC及AS模型對NF-κB核易位率均有升高作用；而且染毒因素與模型因素還存在一定的交互作用，表現(xiàn)在AS模型與WSC、ASC對于升高NF-κB核易位率具有協(xié)同作用。詳見表9、表10。

3討論

PM_2.5健康效應(yīng)的生物學(xué)起因和作用機制尚不十分清楚。PM_2.5的生物學(xué)效應(yīng)主要與顆粒物吸附的有機化合物種類及含量有關(guān)^［13］；無機成分，特別是其中的一些過渡金屬起著重要的作用^{［14，15］}。而在本研究中所關(guān)注的則是PM_2.5的水溶性成分和酸溶性成分。

3.1氧化應(yīng)激損傷本研究顯示，PM_2.5酸溶性成分染毒組較其余各組染毒后SOD降低最為顯著，說明PM_2.5酸溶性成分可使機體抗氧化能力降低。另外，PM_2.5上的一些吸附物質(zhì)代謝產(chǎn)生自由基，或生成活性中間產(chǎn)物再引發(fā)自由基反應(yīng)，攻擊體內(nèi)脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸，使之過氧化，從而增加細胞的脆性，損傷巰基酶，對細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。本次實驗顯示：PM_2.5酸溶性成分染毒組MDA顯著高于其余各組，說明PM_2.5酸溶性成分作用于大鼠后，引發(fā)了脂質(zhì)過氧化作用，形成了較多的脂質(zhì)過氧化物。同時又由于抗氧化能力的下降，使機體清除自由基的能力降低。大氣污染物能夠激發(fā)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失去平衡^［16］，進而造成大鼠脂質(zhì)過氧化損傷，大量形成ox-LDL，通過受損的內(nèi)膜，堆積于血管壁，加重血管的動脈粥樣硬化病變。同時脂質(zhì)過氧化作用發(fā)生于血管內(nèi)皮細胞時，還會進一步加重內(nèi)皮的損傷，繼而引起一系列改變。如血管內(nèi)皮裂隙增大，通透性增加，促使脂質(zhì)在血管內(nèi)膜下沉積，加重AS；破損的內(nèi)皮還可促進單核巨噬細胞趨化并激活分泌各種炎癥和細胞因子，如IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α等，另血管白細胞移動改變從而導(dǎo)致血液流動性降低，引起血管重塑，使血管變得僵硬，壓力負荷增加，進一步加劇AS。PM_2.5酸溶性成分具有氧化損傷作用，推測這至少是PM_2.5加重AS的途徑之一。

3.2加劇炎癥反應(yīng)本研究表明PM_2.5染毒后，TNF-α、IL-6及心肌組織NF-κB均顯著升高，其中酸溶性成分染毒后以IL-6及NF-κB升高為主，而水溶性成分染毒后則表現(xiàn)在TNF-α及NF-κB的升高。炎性損傷不但可以加重AS病變處的炎癥反應(yīng)，同時還能繼發(fā)性引起機體炎癥細胞向病變處聚集，促進單核細胞、巨噬細胞的黏附并向血管內(nèi)皮下遷移、浸潤，從而加重AS的發(fā)生與發(fā)展。

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作者簡介：藥紅梅（1979—），女，畢業(yè)于山西醫(yī)科大學(xué)，講師，現(xiàn)工作于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院（郵編：030001）；呂吉元，工作于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院。

（收稿日期：2011-02-11）

（本文編輯王雅潔）