烏司他丁對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷caspase-3表達的影響

摘要：目的觀察烏司他丁對腦缺血再灌注損傷的保護作用，探討其作用機制。方法健康雄性Wistar大鼠24只，隨機分為4組，假手術組、生理鹽水對照組、烏司他丁10 000 U/kg治療組，烏司他丁50 000 U/kg治療組。采用線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注模型，缺血1 h，再灌注24 h。HE染色觀察大鼠腦組織的病理改變、免疫組織化學法檢測腦組織caspase-3蛋白的表達、TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡數。結果烏司他丁可明顯降低腦缺血再灌注中腦組織caspase-3蛋白的表達，減少腦細胞凋亡，與生理鹽水對照組相比差異有統計學意義（P<0.0１）。結論烏司他丁對腦缺血再灌注損傷有保護作用，可能與下調腦組織caspase-3蛋白表達，減少腦組織凋亡有關。

關鍵詞：烏司他丁 腦缺血再灌注 caspase-3 細胞凋亡

中圖分類號：R743.3R285.5文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0580-02

烏司他丁（Ulinastatin），又稱尿抑制素，是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化得到的一種糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑（ulinary trypsin inhibitor，UTI）。烏司他丁具有保護腦缺血再灌注損傷的作用^［1-3］。本研究采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察烏司他丁對大鼠腦組織caspase-3表達及細胞凋亡的影響，探討其腦保護作用及可能的機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠（山西醫科大學生理實驗室提供）24只，體重200 g~250 g。

1.1.2試劑與藥物烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司，批號03091116），規格為每瓶100 000 U;caspase-3免疫組化試劑盒、TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1分組及給藥方法大鼠隨機分為4組，每組6只。假手術組（A組）、對照組（B組）、烏司他丁10 000 U/kg治療組（C組）、烏司他丁50 000 U/kg治療組（D組）。B組在制作模型后立即給予生理鹽水1 mL尾靜脈注射；C組、D組制作模型后分別立即給予烏司他丁10 000 U/kg、50 000 U/kg尾靜脈注射，每次12 h，直至處死。

1.2.2模型制作用改良Longa 法建立大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注模型。大鼠造模前禁食12 h，不禁水，室溫條件下稱重，將大鼠用10%水合氯醛3 mL/ kg腹腔麻醉，頸正中旁開0.5 cm～1 cm切口，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈、頸總動脈近心端，血管夾夾閉頸內動脈，在頸總動脈距離分岔口大約5 cm處用眼科剪剪開一小口，將直徑約0.23 mm～0.26 mm的漁線插入，松開血管夾，以分岔口開始測量距離，插入1.8 cm～2 cm后固定漁線，縫合。缺血1 h后將線栓拉出1 cm，形成再灌注。假手術組插入1.0 cm漁線，其余步驟同實驗組。待動物蘇醒評估神經功能后放回籠中，自由飲食。神經功能缺陷評分按照Longa的5級4分法標準。

1.2.3標本及病理切片制備B組、C組、D組在缺血1h再灌注24 h、A組在24 h后，給予10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口作出口，用生理鹽水200 mL經左心室到主動脈快速沖洗血液，后用4%多聚甲醛200 mL快速灌注，斷頭取腦。取大鼠右側腦組織4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，從視交叉向后做冠狀面連續切片，厚約5 μm。

1.2.4HE染色切片常規脫蠟、梯度酒精脫水、蘇木素及伊紅染色，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.5免疫組化測caspase-3蛋白表達切片常規脫蠟至水，3%H₂O₂浸泡10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 min×3次，高壓修復2 min，室溫下自然冷卻至常溫，PBS緩沖液洗滌3 min×3次，滴加5%BSA封閉液37 ℃放置20 min，滴加一抗約100 μL，4 ℃過夜，PBS緩沖液洗滌3 min×3次，滴加二抗約100 μL，37 ℃ 30 min，PBS緩沖液洗滌3 min×3次，滴加SABC試劑，37℃放置20 min，PBS洗滌3 min×3次，滴加生物素過氧化物酶（DAB）顯色，之后蘇木素復染，脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察caspase-3顯色情況，細胞核或漿棕染為陽性。每只大鼠選取5張切片，400倍光鏡下隨機選取5個不重復的視野，計數其中的陽性細胞，求均值。

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡切片常規脫蠟至水，嚴格按照試劑盒步驟操作，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。胞核呈棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片在400倍下隨機選取不重疊的5個視野，計數TUNEL陽性細胞數。

1.3統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(x±s) 表示，采用單因素方差分析進行統計，組間比較采用Bonferroni法。

2結果

2.1HE染色結果A組神經元形態正常，胞體呈圓形，胞漿豐富，核仁清楚，無變形、水腫；B組腦組織結構疏松，有不同程度的神經細胞變性、壞死，胞體腫脹、變形，細胞周圍間隙增寬，胞核深染、固縮。C組、D組神經細胞病理改變輕微，胞體輕度腫脹，偶有神經細胞變性、壞死。

2.2腦組織caspase-3蛋白表達情況Caspase-3陽性細胞呈棕黃色，顯色部位為胞漿，A組caspase-3陽性細胞表達少，B組陽性細胞數較假手術組顯著增加，C組、D組caspase-3陽性細胞數較生理鹽水對照組明顯減少（P<0.01）。詳見表1。

2.3TUNEL法測細胞凋亡結果A組凋亡細胞幾乎無表達，B組凋亡細胞表達較假手術組明顯增加，多集中在海馬區，C組、D組凋亡細胞數較對照組減少（P<0.01）。詳見表１。

3討論

腦缺血再灌注損傷后神經細胞存在著凋亡和壞死兩種死亡方式。哺乳動物存在兩種不同的細胞凋亡途徑，一種是“凋亡受體途徑”，一種是bcl-2家族調控的凋亡途徑，兩種凋亡途徑最終都會激活細胞的半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）^［4］。半胱天冬氨酸蛋白酶也稱ICE樣蛋白酶，是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶。它可直接導致細胞凋亡，它的活化是細胞凋亡通路的中心環節^［5］。其中caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，是caspase級聯反應中的最終效應因子和最關鍵的凋亡執行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用^［6］。caspase-3與細胞凋亡關系密切。

烏司他丁可通過抑制NO和TNF-α的釋放，對腸組織缺血再灌注損傷產生保護作用^［7］。Jiang等^［8］ 發現烏司他丁能抑制失血性休克大鼠回腸組織caspase-3蛋白的表達，抑制組織細胞凋亡，產生細胞保護作用。通過抑制TNF-α、纖溶酶等的活性對活體肺缺血再灌注損傷產生保護作用^［9］。同時可穩定細胞膜，抑制蛋白質分解代謝亢進，抑制IL-6、IL-8的過度生成及ICAM-1的表達。通過抑制NOS活性，減少NO的生成，保護血腦屏障，減輕腦水腫。

本實驗中，建立大鼠腦缺血再灌注模型，結果顯示生理鹽水對照組caspase-3陽性細胞數及凋亡細胞數顯著高于假手術組，是由于在生理鹽水對照組中因缺血及再灌注損傷，線粒體受損，線粒體膜通透性改變，細胞色素C釋放，激活半胱天冬氨酸蛋白酶，最終激活caspase-3，導致神經細胞凋亡。而在治療組中，caspase-3及凋亡陽性表達細胞數較生理鹽水對照組顯著降低，可能與烏司他丁抑制caspase-3的激活有關，減輕缺血再灌注損傷，產生腦保護作用。

烏司他丁對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，它可減少神經細胞的凋亡，其機制可能與抑制caspase-3的表達有關。烏司他丁源于人體，無免疫原性，不良反應少，安全性高，臨床上已廣泛應用于胰腺炎、休克、全身炎癥反應的治療，且有較好的效果。

參考文獻：

［1］薛繼紅，余唯琪.烏司他丁對缺氧缺血性新生鼠的腦保護作用［Ｊ］.中國新生兒科雜志，2007，22（1）：24-26.

［2］Koga Y，Fujita M，Tsuruta R，et al.Urinary trypsin inhibitor suppresses excessive superoxide anion radical generation in blood，oxidative stress，early inflammation，and endothelial injury in forebrain ischemia/reperfusion rats［Ｊ］.JNeurol Res，2010，48(3):256-265.

［3］Yaw T，Anraku S，Nakayama R，et al.Neuroprotive effet of orinary trypoin inhibitor against facal cerebral ischemia-reperfusion in rats［Ｊ］.Anestheiology，2003，98(2):465-473.

［4］An S，Hishikawa Y，Koji T.Induction of cell death in rat small intestine by ischemia reperfusion:Differential roles of Fas/Fas ligand and Bcl-2/Bax systems depending upon cell types.［Ｊ］.Histochem Cell Biol，2005，123(3):249-261.

［5］Faubel S，Edelstein CL.Caspase as drug targets in ischemic organ injury［Ｊ］.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol，2005，5(3):269-287.

［6］Yang Y，Zhang S，Fang Sy，et al.Induction of caspase-3 gene in neuronal apoptosis after transient focal cerebral ischemia［Ｊ］.Chin Clin Neurosci，2004，12(1)：1-4.

［7］Liu ML，Zhang J，et al.Protective effect of urinary trypsin inhibitor on injury after intestinal ischemia-reperfusion:Experiment with rats［Ｊ］.Chin Med J，2008，88(4):225-229.

［8］Jiang LY，Yang LH，Zhong W，et al.Effect of ulinastatin on apoptosis in ileal mucosa of rats with hemorrhagic shock［Ｊ］.Chin Crit Care Med，2006，18(9):542-545.

［9］谷力加，黃邵洪，吳一龍，等.烏司他丁對兔在體肺缺血再灌注損傷的保護作用［Ｊ］.中華實驗外科雜志，2002，19（6）：585-586.

作者簡介：吳倩佳(1984—)，女，現為山西醫科大學2008級在讀碩士研究生（郵編：030001）；李光來（通訊作者），工作于山西醫科大學第二醫院（郵編：030001）。

(收稿日期：2010-12-06）

(本文編輯王雅潔）