大鼠腦出血模型腦組織NgR的表達形式

摘要：目的觀察大鼠腦出血后不同時間點腦組織NgR(Nogo-66 Receptor )的表達情況。方法大鼠斷尾取血100 μL，分3次注入大腦尾狀核，分別于手術后6 h、24 h、48 h、72 h和7 d處死動物。采用免疫組織化學方法檢測腦組織NgR的表達變化。結果與假手術組相比較，腦出血后6 h，NgR表達增高(P<0.01)，72 h達到高峰(P<0.01)，7 d后降低但仍然高于假手術組(P<0.01)。結論NgR的上調是腦出血的重要特征之一，并且在腦組織的病理損害過程中起著重要作用。

關鍵詞：腦出血 NgR 免疫組織化學 軸突再生

中圖分類號：R743.3R285.5文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0579-02

哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，受損神經(jīng)元軸突再生非常有限。已有實驗證實軸突生長抑制蛋白髓鞘相關糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG)、Nogo-A和少突膠質細胞/髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp ) 可以通過其共同受體NgR-66受體（NgR)介導信號傳導，造成生長錐塌陷，對軸突再生產生抑制作用^［1］。因此，可以對NgR進行干預以促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生^［2］。但近年來，關于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NgR的研究主要集中于脊髓外傷^［3］、視神經(jīng)損傷^［4］、腦梗死等^［5］。但是腦出血后腦組織NgR的表達情況，特別是時間依賴性的表達研究報道仍然缺乏。

腦出血占所有卒中的10%～15%，動物實驗提示最初的機械性損害及占位效應，血塊源性的因素是造成腦出血腦損傷中重要的因素^［6］。目前缺乏有效的藥物和治療措施來減輕損傷和促進軸突再生以改善神經(jīng)功能。本實驗旨在研究腦出血后腦組織NgR時間依賴性的變化及表達規(guī)律，為腦出血治療提供新的時間窗，提高腦出血后的神經(jīng)功能恢復。

1材料與方法

1.1動物與分組Wistar大鼠由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，活動靈活的200 g~250 g成年大鼠，分為6組。假手術組及5個腦出血組（6 h，24 h，48 h，72 h及7d）。腦出血組大鼠分別于出血后6 h，24 h，48 h，72 h及7 d處死。假手術組大鼠在腦出血6 h后處死。

1.2腦出血模型采用自體血三次注血法建立^［7］。采用微量注射器從顱骨預先鉆好的小孔（中線旁開2 mm，前囟前1 mm，深度5.5 mm）注入。首先注入20 μL，停留10 min后，40 μL血在2 min內緩慢注入，最后40 μL的血以同樣的方式注入，停留10 min。假手術組造模方法類似，扎針不注射血。

1.3免疫組織化學染色斷頭取腦后，將腦組織置于4 ℃ 的4%多聚甲醛中浸泡8 h~12 h，后經(jīng)過石蠟包埋。制作5μm切片進行HE染色和免疫組織化學染色，采用親和生物素法的試劑盒。陽性對照：隨機抽取多個樣本重復證實標志物的存在。陰性對照:采用非免疫的血清代替一抗進行實驗。采用BI-2000醫(yī)學圖像系統(tǒng)分析NgR表達情況，每張切片隨機選取10個視野進行OD值的測定。免組織化的程度通過OD值進行半定量分析。

2結果

2.1HE 染色對照組腦組織正常，組織形態(tài)正常，細胞結構完整。腦出血6 h有少量的壞死神經(jīng)元和散在炎性細胞浸潤，炎癥細胞浸潤在腦出血后24 h逐漸上升，72 h達到高峰，并在血腫周圍出現(xiàn)膠質細胞和毛細血管增生。在腦出血7 d時，血腫明顯減輕，血腫周圍出現(xiàn)明顯膠質和毛細血管增生。

2.2腦皮質NgR免疫組織學觀察腦出血6 h血腫周圍開始出現(xiàn)少量的NgR陽性細胞。陽性表達高于對照組，平均光密度值高于對照組（P<0.01)。之后隨著時間的延長，NgR表達在腦出血后 24 h，48 h，72 h逐漸增多，但在7 d時有所降低，但仍高于 6 h，24 h 及假手術組。同時，光密度值也在腦出血后24 h逐漸增高(P<0.01)，72 h到達高峰(P<0.01），與對照組相比，7 d降低。詳見圖1。

圖1腦皮質NgR表達平均光密度值

3討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織NgR的表達在腦出血后12 h，24 h，48 h，72 h呈時間依賴性上調。腦組織NgR的表達形式與腦組織急性期損傷程度變化相一致。 在實驗動物腦出血模型中，腦出血周圍組織在沒有出現(xiàn)脫髓鞘的情況下，出現(xiàn)了軸突損害^［8］。在本實驗中，NgR作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后抑制軸突再生的重要因素，在手術后72 h表達最高。說明NgR可能在腦出血早期參與了軸突損害過程。腦出血后NgR表達形式局灶性腦梗死腦組織NgR的表達情況不同，這可能與腦出血后凝血級聯(lián)以及紅細胞破裂后的產物有關^［6］。

NgR的發(fā)現(xiàn)以及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突起再生中的抑制性作用促使人們對其進行了大量的研究。近些年，人們試圖通過多種方法從基因水平，蛋白水平對NgR干預以促進軸突的再生。在離體及在體實驗中均發(fā)現(xiàn)應用抗NgR的DNA疫苗可以明顯促進脊髓損傷后的軸突再生^［9］。 通過皮下注射NgR拮抗肽NEP1-40促進脊髓損傷患者軸突的重塑^［10］。側腦室給予NgR受體拮抗劑，可以明顯提高小鼠腦梗死模型軸突的可塑性，從而促進神經(jīng)功能恢復^［11］。這些研究在進一步證實NgR作用的同時為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害治療提供了新的治療措施。但是新的治療方法需要不斷完善以治療腦出血后神經(jīng)功能的惡化。本實驗發(fā)現(xiàn)腦出血后12 h NgR在腦白質表達逐漸上調，在72 h達到高峰，7 d時開下降。此研究結果將為采用NgR抗體治療腦出血促進神經(jīng)功能恢復提供切實有效的時間窗。

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作者簡介:賈曉濤(1985—)，男，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內科2008 級在讀碩士研究生（郵編:030001)；李東芳（通訊作者)，工作于山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院（郵編:030001)；羅崗、劉正姣，為山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內科2008 級碩士研究生；潘艷芳，現(xiàn)為協(xié)和醫(yī)科大學2010級生物化學與分子生物學專業(yè)博士研究生。

（收稿日期:2010-11-16）

(本文編輯王雅潔）