尼古丁對臍靜脈內(nèi)皮細胞釋放IL-6及PAI-1的影響

摘要：目的探討尼古丁干預人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）后，白介素-6（IL-6）和纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）抗原的表達變化，并分析其相關性。方法將4～6 代HUVECs接種于24孔培養(yǎng)板。隨機分為對照組與不同濃度尼古丁組。尼古丁濃度分別為0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10 μmol/L與100 μmol/L。12 h后收集各組細胞上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法(ELISA)測定各組細胞上清液中IL-6、PAI-1抗原濃度。結(jié)果各濃度尼古丁組HUVECs釋放IL-6抗原呈濃度依賴性增高，各尼古丁組IL-6含量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。100 μmol/ L尼古丁組PAI-1含量與對照組比較升高（P<0.05）。HUVECs釋放PAI-1與IL-6呈正相關（P<0.05）。結(jié)論在體外，尼古丁可誘導HUVECs 釋放IL-6、PAI-1增多，參與內(nèi)皮損傷、炎癥與纖溶活性紊亂。

關鍵詞：尼古丁 臍靜脈內(nèi)皮細胞 白介素-6 纖溶酶原激活物抑制物-1

中圖分類號：R329.2文獻標識碼：B文章編號：1672-1349(2011)05-0525-02

血栓性疾病是臨床常見病之一，內(nèi)皮損傷、炎癥反應及纖溶系統(tǒng)功能紊亂與該病發(fā)生密切相關，內(nèi)皮細胞損傷是其始動因素。尼古丁作為香煙煙霧的主要有害成分之一，可以活化炎性細胞^［1］，引發(fā)炎癥反應，從而影響內(nèi)皮細胞功能^［2］。在體外，尼古丁可介導內(nèi)皮細胞釋放纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）增多，導致纖溶系統(tǒng)功能紊亂^［3］。本文以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）為模型，通過不同濃度尼古丁干預HUVECs，探討內(nèi)皮細胞PAI-1抗原表達與炎癥因子的關系。

1材料與方法

1.1試劑HUVECs細胞株購自上海門諜塔生物科技發(fā)展有限公司。實驗用尼古丁溶液購自美國Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，RPMI -1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國 Gibco公司。 PAI-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司，人白介素-6（IL-6）ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2HUVECs培養(yǎng)和鑒定HUVECs用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在 37 ℃、5%CO₂孵箱中培養(yǎng)，隔日換液1次，待細胞生長至亞融合狀態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2傳代至第4～6 代，接種于24孔培養(yǎng)板上，倒置顯微鏡下觀察可見細胞呈多形“鋪路石”樣排列。

1.3實驗分組待接種于24孔培養(yǎng)板上的第4～6代HUVECs 達90%融合后隨機分為對照組與尼古丁組。對照組：培養(yǎng)液中加入與尼古丁相同體積的PBS液，相同實驗條件孵育細胞12 h；不同濃度尼古丁組：培養(yǎng)液中分別加入終濃度為0.1 μmol/ L、1.0 μmol/ L、10 μmol/ L與100 μmol/ L的尼古丁，即尼古丁1組、2組、3組與4組。37 ℃、5%CO₂與HUVECs孵育12 h。

1.4ELISA測定PAI-1抗原將PAI-1標準品準確復溶，用稀釋液做6次倍比稀釋，PAI-1標準品濃度分別為120 ng/mL、60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL、3.75 ng/mL及1.875 ng/mL。以A490對PAI-1的標準品濃度在雙對數(shù)坐標系（PAI-1）上作標準曲線，待測樣品PAI-1含量由標準曲線上得出。

1.５ELISA測定IL-6抗原將1 mL樣品稀釋液加入重組人IL-6凍干標準品內(nèi)，配制為10000pg/mL。取30μL 10 000 pg/mL的標準品加入有970 μL樣品稀釋液中，配制為300pg/mL的標準品。余同此類推，分別用稀釋液做6次倍比稀釋。將所有的標準品和樣品的吸光值在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。

1.６統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析SNK-q檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。

2結(jié)果

2.1HUVECs形態(tài)觀察在倒置相差顯微鏡下觀察HUVECs，可見其形態(tài)不規(guī)則，呈扁平、橢圓形、梭形或多角形，為單層鵝卵石狀鑲嵌排列，細胞單層融合時呈典型的“鋪路石”樣外觀。

2.2不同濃度尼古丁對HUVECs釋放PAI-1與IL-6的影響HUVECs釋放IL-6抗原呈尼古丁濃度依賴性增高趨勢，各尼古丁組IL-6含量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。100 μmol/ L尼丁組PAI-1含量高于對照組（P<0.05）。詳見表1。

2.3相關性分析經(jīng)Pearson相關分析，各組PAI-1與IL-6呈正關（r＝0.712，P<0.05）。

3討論

內(nèi)皮細胞損傷可引起炎癥因子釋放和纖溶系統(tǒng)紊亂^［4］，它們之間有著交聯(lián)作用。而對于吸煙者內(nèi)皮損傷表現(xiàn)為吸煙后循環(huán)內(nèi)皮細胞死亡增加。在體外，尼古丁可以活化炎性細胞，調(diào)控細胞凋亡和增殖，誘導內(nèi)皮細胞分泌細胞間黏附因子、血管黏附因子、腫瘤壞死因子及白介素-１等細胞因子。本實驗通過0.1 μmol/ L、1.0 μmol/ L、10 μmol/ L與100 μmol/ L尼古丁干預HUVECs后，觀察到各組上清液中IL-6含量增高，與尼古丁呈濃度依賴性，各組與對照組相比均有統(tǒng)計學意義。IL-6作為體內(nèi)的一種重要的炎癥因子可刺激細胞間黏附分子（ICAM）表達上調(diào)^［5］，促進白細胞與內(nèi)皮細胞黏附；誘使化學趨化因子的表達，進一步在病灶區(qū)域募集大量炎性細胞，進行局部炎癥反應，引起內(nèi)皮細胞損傷和凋亡。

尼古丁可以損傷內(nèi)皮細胞引起炎癥介質(zhì)釋放，在本試驗及相關報道已經(jīng)得到證實。尼古丁可以引起纖溶紊亂，但確切機制報道較少。PAI-1在纖溶系統(tǒng)中起著決定性作用，PAI-1活性和水平的高低決定著纖溶系統(tǒng)活性的高低程度，是纖溶受損和血栓形成的標志物，主要由內(nèi)皮細胞及肝細胞合成和釋放，內(nèi)皮細胞合成和釋放PAI-1的增加是血栓形成的獨立危險因素^［6］。PAI-1可以促進中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞趨化運動及上調(diào)炎癥因子^［7］。本實驗通過不同濃度的尼古丁干預HUVECs后觀察到培養(yǎng)液中IL-6、PAI-1抗原含量明顯增加，二者與尼古丁呈濃度依賴性，并且二者呈正相關，可以推測尼古丁損傷HUVECs后，引起IL-6、PAI-1釋放，二者通過炎癥反應加重損傷內(nèi)皮細胞，引起IL-6、PAI-1釋放增加，這樣形成正反饋，最終引起PAI-1含量增加，導致纖溶紊亂。在誘導狒狒DIC模型中，用IL-6預處理后血漿中PAI-1增加20倍。在兔深靜脈栓塞模型中可見內(nèi)皮細胞損傷，PCR檢測IL-6 mRNA、PAI-1 mRNA均升高。

IL-6水平的升高與內(nèi)皮細胞功能紊亂密切相關，是預測血栓性疾病的獨立危險因素^［8，9］。PAI-1是血栓性疾病的重要標志物，故聯(lián)合檢測IL-6、 PAI的抗原表達可為血栓性疾病的診斷提供理論依據(jù)。

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作者簡介：薄美玉，女，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學在讀碩士研究生，工作于山西省朔州市第一人民醫(yī)院（郵編：036000）；胡曉蕓（通訊作者）、韓葆芬、扈麗娟、杜艷，工作于山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院（郵編：030001）。

（收稿日期：2011-02-15）

（本文編輯王雅潔）