從鈣超載角度探討通脈養心丸心肌保護作用的機制

摘要：目的從抑制鈣超載的角度探討通脈養心丸抗細胞凋亡保護心肌的作用機制。方法采用大鼠心肌細胞原代培養方法獲得正常心肌細胞并建立缺氧損傷細胞模型，采用FLIPR Calcium 4 試劑盒檢測藥物對胞漿內鈣離子濃度變化的影響；Annexin V/PI雙染法檢測心肌細胞總凋亡率。結果缺氧損傷組心肌細胞胞漿內鈣離子濃度顯著升高（P<0.01），通脈養心丸各劑量組變化不顯著；再次加藥后，通脈養心丸各劑量組胞漿內鈣離子濃度均顯著低于缺氧損傷組（P<0.01）。缺氧損傷組心肌細胞凋亡率顯著升高（P<0.01），通脈養心丸4 g/kg、8 g/kg劑量組可顯著降低心肌細胞凋亡率（P<0.01）。結論抑制心肌細胞鈣超載是通脈養心丸抗心肌細胞凋亡保護心肌的作用機制之一。

關鍵詞：通脈養心丸 心肌細胞 鈣超載 細胞凋亡

中圖分類號：R542.2R289.5文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0562-02

Investigation of Protection Mechanism of Tongmai Yangxin Pill on Myocardium from the Perspective of Calcium Overload

Xiao Yang，Zhang Jiafu，Zhang Ling，et al

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin 300193)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Tongmai Yangxin pill (TYP) on apoptosis and ［Ca²⁺］i in cultured hypoxia cardiomyocytes，and explore the mechanism of myocardial protection.MethodsPrimarily cultured neonate rat cardiomyocytes were used to establish the hypoxia models.［Ca²⁺］i of cardiomyocytes loaded by Fluo-4 was analyzed by Multiskan Ascent immediately.The apoptosis percentage of cardiomyocytes was measured by Annexin V/PI flow cytometry.ResultsCalcium in hypoxia cardiac myocytes injury group was significantly higher. Calcium in TYP group were significantly lower than that in hypoxic injury group(P<0.01).Myocardial hypoxia significantly increased apoptosis rate(P<0.01).The apoptosis rate was significantly reduce in 4 g/kg TYP group and 8 g/kg TYP group(P<0.01).ConclusionTYP could inhibit calcium overload in myocardial cells，thereby to reduce the incidence of myocardial apoptosis.

Key words：Tongmai Yangxin pill；Cardiomyocytes；Calcium overload；apoptosis

通脈養心丸是由傳統組方生脈散與炙甘草湯加減而成，具有養心補血、通脈止痛的功效。臨床主要用于胸痹心痛、心悸怔忡等證的治療。長期臨床實踐表明，通脈養心丸可有效緩解胸痛、胸悶憋氣、心悸氣短等癥狀，減少心絞痛發作頻數。但對其藥理作用機制的研究尚不完善。本研究采用大鼠心肌細胞原代培養方法獲得實驗用正常心肌細胞，并建立缺氧損傷細胞模型，從抑制心肌細胞鈣超載的角度探討通脈養心丸抗細胞凋亡，保護心肌的作用機制，為臨床應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠，50只，體重300 g±20 g，雄性，購于中國醫學科學院協和動物研究所。Wistar大鼠，20只，1 d~3 d齡，雌雄不拘，購于中國醫學科學院放射研究所。

1.2藥品與試劑通脈養心丸（天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠提供，每10丸重1 g，C107074）；DMEM/F12培養基(Hyclone，NUH0180)；胰蛋白酶（1:250，sigma）；Ⅱ型膠原酶（Gibco，461699）；5，-溴脫氧尿苷（brdu，sigma）;FLIPR Calcium 4 Assay Kit(Molecular Devices，122625)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（BD，批號：18354）。其他試劑為國產分析純。

1.3主要儀器37 ℃ 5%CO₂培養箱（THERMO，FORMA3111型，美國）；37 ℃ 94%N₂-5%CO₂-1% O₂培養箱（THERMO，FORMA3131型，美國）；倒置相差顯微鏡(LEICA DMIL，德國)；臺式高速低溫離心機(Biofuge primo R，美國)；多功能讀板機（Multiskan Ascent，THERMO LABSYSTEMS，美國）；流式細胞儀（FACS，美國）。

1.4含藥血清的制備將50只Wistar 大鼠隨機分為空白對照組及通脈養心丸1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg（日給藥量）劑量組，連續給藥3 d，于末次給藥1 h后腹主動脈取血，56 ℃水浴孵育30 min滅活補體，3 000 r/min離心15 min后取血清，無菌條件下過濾分裝入凍存管中，-20 ℃保存備用。

1.5心肌細胞原代培養及缺氧損傷模型制備心肌細胞原代培養參照文獻方法^［1］加以改良。取1 d~3 d齡 Wistar大鼠經75%酒精消毒30 s，將心室肌剪成（1～2） mm³的組織塊培養。收集未貼壁的細胞懸液并調整細胞濃度至5×10⁵/mL，接種于培養板中，于5%CO₂培養箱中培養48 h后換液。前3 d用0.1 mmol/L 5，-溴脫氧尿苷（Brdu）以抑制非心肌細胞生長。

分組及缺氧損傷模型，取穩定生長的單層心肌細胞，用無血清DMEM/F12培養液培養48 h，使細胞生長同步化，并將細胞分為6組：正常對照組、缺氧損傷組及通脈養心丸1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg劑量組。采用MODEL3131型三氣培養箱，94%N₂、5%CO₂、1%O₂條件下缺氧孵育24 h，正常對照組于原條件下培養。

1.6檢測指標 MTT比色法測定心肌細胞活力，并應用分析軟件對心肌細胞漿鈣離子濃度百分率與心肌細胞凋亡率進行相關性考察與回歸分析，論證二者是否具有某種相關性。心肌細胞胞漿內鈣離子濃度，數據用每孔細胞再次加藥后熒光值占空白組熒光值的百分率表示。計算凋亡細胞百分率。

1.7統計學處理數據以均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 11.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析。

2結果

2.1通脈養心丸對心肌細胞活力的影響心肌細胞在缺氧條件下孵育后，其活力下降，與正常對照組比較有統計學意義（P<0.01）。證明缺氧損傷模型建立成功。通脈養心丸各個劑量組均能不同程度提高缺氧損傷心肌細胞活力，其中1 g/kg劑量組與缺氧損傷組比較有統計學意義(P<0.05)；通脈養心丸2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg劑量組與缺氧損傷組比較有統計學意義(P<0.01)。詳見表1。

2.2對缺氧損傷心肌細胞胞漿中鈣離子濃度變化的影響缺氧孵育24 h后缺氧損傷組胞漿中鈣離子濃度與正常對照組比較有統計學意義（P＜0.01）。再次加藥后，約在40 s后各組細胞胞漿內鈣離子濃度達到峰值，各給藥組峰值與缺氧損傷組比較差異有統計學意義（P＜0.01），其中8 g/kg組效果最為明顯。再次加藥80 s~300 s各組鈣離子濃度逐漸趨于穩定，此時各給藥組鈣離子濃度仍顯著低于缺氧損傷組（P＜0.01）。詳見圖1。

與空白對照組比較，1） P<0.01；與缺氧損傷組比較，2） P<0.01

圖1通脈養心丸對缺氧心肌細胞鈣離子熒光強度的影響

2.3對缺氧損傷心肌細胞凋亡率的影響心肌細胞經缺氧損傷后，與空白對照組相比細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）；通脈養心丸4 g/kg、8 g/kg劑量組與缺氧損傷組比較能明顯降低缺氧心肌細胞凋亡率（P<0.01）。詳見表2。

2.4胞漿鈣離子濃度與凋亡率的相關性各劑量組鈣離子濃度熒光百分率與細胞凋亡率相關系數為0.945，成明顯正相關。經回歸分析95%可信區間（P<0.05），二者存在線性回歸關系。

3討論

通脈養心丸全方由生脈散與炙甘草湯加減而成，具有養心補血，通脈止痛的功效。方中地黃、雞血藤、何首烏以及麥冬均具有鈣離子拮抗作用，可不同程度抑制鈣超載^［2，3］ 。

細胞凋亡信號的異常表達使心肌細胞數量不可逆地減少，加重了心肌缺血損傷^［4］。其發生凋亡的機制可能與長時間缺氧產生細胞內鈣超載有關^［5］。鈣離子作為多種死亡信號轉導的第二信使與細胞線粒體凋亡有著錯綜復雜的關系^［6］，心肌缺血發生時，大量鈣離子內流，同時鈣離子的排出受到抑制，導致心肌細胞鈣超載。此時，線粒體可釋放CytC，CytC與脫氧腺苷三磷酸相互作用，并與Apaf-1結合，激活白細胞介素-1，3轉化酶-9(Caspase-9)，被激活的Caspase-9又激活Caspase-3，促使細胞發生凋亡 ^［7］。

本實驗結果顯示，缺氧條件可使心肌細胞胞漿內鈣離子濃度顯著升高，通脈養心丸4 g/kg、8 g/kg劑量組可以明顯抑制心肌細胞內鈣離子濃度升高，一定程度上減輕了心肌細胞鈣超載。此外，通脈養心丸4 g/kg、8 g/kg劑量組可明顯降低缺氧損傷引起的大鼠心肌細胞凋亡的發生率，對缺氧損傷的心肌細胞具有明顯的保護作用。

本研究從心肌細胞胞漿內鈣離子濃度變化為切入點，結合心肌細胞凋亡率對通脈養心丸心肌保護機制進行了初步探討，二者的相關性說明該藥能夠通過抑制心肌細胞鈣超載而降低心肌細胞凋亡的發生，進而發揮心肌保護作用。同時提示了該藥劑量與療效間也具有一定的依賴關系。通脈養心丸能否通過其他途徑發揮心肌保護作用仍有待于進一步的研究。

參考文獻：

［1］Michaela A，Tomas S，Helena K，et al.In vitro and in vivo examination of cardiac troponins as biochemical markers of drug-induced cardiotoxicity［Ｊ］.Toxicology，2007，237(2):218-228.

［2］陳丁丁，戴德哉，章濤，等.地黃煎劑抑制異丙腎上腺素誘發的缺血大鼠腦Ca²⁺ -Mg²⁺ -ATP酶活力升高［Ｊ］.中藥藥理與臨床，1997，13(4):27-28.

［3］江濤，唐春萍，李娟妤，等.雞血藤對大鼠主動脈收縮反應的影響［J］.廣東藥學院學報，1996，12(1)：33-35.

［4］陳萬生，劉文庸，楊根金，等.首烏中1個新的四羥基二苯乙烯苷的結構鑒定及其心血管活性研究［Ｊ］.中國藥學學報，2000，35(12):906-908.

［5］Tao J，Wang H，Zhou H，et al.The saponin monomer of dwarf lilyturf tuber，DT-13，reduces L-type calcium currents during hypoxia in adult rat ventricular myocytes［Ｊ］.Life Sci，2005，77(24):3021-3022.

［6］Zhao ZQ，Nakamura M，Wang NP，et al.Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death［Ｊ］.Cardiovasc Res，2000，45(3):651-660.

［7］王保和.心肌缺血再灌注損傷機制研究及中藥治療進展［Ｊ］.天津中醫學院學報，2004，23(2):104-106.

作者簡介：肖揚（1985—），女，碩士研究生，現工作于天津中醫藥大學（郵編：300193）；張家福，工作于天津中新藥業醫藥公司；張玲、邢永發、王怡（通訊作者），工作于天津中醫藥大學（郵編：300193）。

(收稿日期：2011-02-02)

（本文編輯王雅潔）