神經節苷脂聯合參附注射液對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用

摘要：目的探討神經節苷脂（GM1）聯合參附注射液對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）的神經保護作用。方法將新生7 d SD乳鼠90只隨機分為假手術組、缺血缺氧組（HIBD組）、缺血缺氧+ GM1干預組（GM1組）、缺血缺氧+參附干預組（參附組）及缺血缺氧+ GM1及參附干預組（合用組）。在給藥后不同時間點，采用免疫組化法半定量測定腦組織中Bcl-2及Bax含量。結果假手術組海馬CA1區可見少量Bcl-2及Bax表達；HIBD后該區Bcl-2及Bax表達均增加，且Bax表達較明顯；分別應用GM1、參附注射液治療后該區Bcl-2表達進一步增加，而Bax蛋白水平下降；聯合應用兩種藥物治療后該區Bcl-2表達增加、Bax表達下降的趨勢更為明顯。結論新生大鼠腦缺氧缺血后腹腔注射神經節苷脂或參附注射液均可不同程度減輕大鼠腦損傷，兩種藥物聯合應用對其腦損傷的改善作用更為明顯。

關鍵詞:神經節苷脂 參附注射液 腦損傷 Bcl-2 Bax

中圖分類號：R743R285.5文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0576-03

Protective Effect of Ganglioside GM1 and Shenfu Injection on Hypoxia-ischemia Brain Damage in Newborn Rats

Zhang Haijiao，Yin Huaiqing，Li Hong，et al

Department of Paediatrics，The First Clinical Medical College，Shanxi Medical University (Taiyuan 030001)

Abstract:ObjectiveTo explore the neuron-protective effect of ganglioside GM1 and of Shenfu injection（SFI） on hypoxia-ischemia brain damage(HIBD) in newborn rats.MethodsSeven-day-old Wistar rats were randomly divided into five groups：Sham-operation group，HIBD group，ganglioside GM1 treatment group，SFI treatment group，and combination treatment group.After the drug injection，the content of Bcl-2 and Bax in brain tissue was measured by immunohistochemical method at different time points.ResultsBcl-2 and Bax were low expressed in sham operation group，but the expression was increased after HIBD，especially for the expression of Bax.While GM1 and Shenfu injection treatment were separated，the expression of Bcl-2 got higher and expression of Bax was over.The most obvious change was happened in combination treatment group.ConclusionGanglioside GM1 and SFI could reduce the brain damage in newborn rats with HIBD.Ganglioside GM1 combined with SFI could enhance the effect for reducing the brain damage.

Key words:ganglioside GM1；Shenfu injection；brain damage；Bcl-2；Bax

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指嬰兒在圍生期、分娩期、出生后發生窒息，導致腦

1）為太原市科技局科技興市基金資助項目（No.0705-026）

組織缺氧性損傷，是新生兒的常見病之一。 HIE發病機制復雜，涉及多個環節，而細胞凋亡是后期神經細胞缺失和功能障礙的重要原因。本實驗主要探討在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后，應用神經節苷脂（GM1）及參附注射液治療后其腦組織中Bcl-2，Bax的變化趨勢，從理論角度分析，聯合應用兩種藥物對新生大鼠HIE后神經系統功能恢復具有更為明顯的改善作用。

1材料與方法

1.1材料實驗動物，清潔級，封閉群，新生7 d SD乳鼠，體重12 g ～18 g，雌雄不限，購自山西醫科大學動物實驗中心。

1.2試劑與藥品Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體購自北京中杉試劑公司；Bax兔抗大鼠多克隆抗體購自北京中杉試劑公司；免疫組化二步法檢測試劑盒（PV6001）購自北京中杉試劑公司；神經節苷脂注射液系山東齊魯制藥有限公司生產（批號H20103722）；參附注射液系雅安三九藥業有限公司生產（批號031118）。

1.3方法

1.3.1動物分組新生7 d SD乳鼠90只，隨機分為5組（n=18），假手術組、缺血缺氧組（HIBD組）、缺血缺氧+GM1干預組（GM1組）、缺血缺氧+參附干預組（參附組）及缺血缺氧+GM1及參附干預組（合用組）。

1.3.2動物模型制備參照Rice^［1］方法制備HIBD模型，缺血缺氧完成后立即予GM1腹腔注射（20 mg/kg）每日1次；參附組腹腔注射參附注射液（10 mg/kg）每日1次；合用組腹腔注射兩種藥物。假手術組僅切開頸部皮膚，分離左側頸總動脈后不予結扎，縫合切口后不予低氧處理。

1.3.3標本制作各組分別于術后6 h、24 h、48 h處死動物取腦組織，分離左側大腦半球（即頸總動脈結扎側）做冠切，留取皮層及海馬腦組織（5 mm），放入10%中性甲醛固定液中固定6 h～24 h，然后常規石蠟包埋，切片。

1.3.4HE染色按切片-烤片-脫二甲苯-梯度酒精水化-染色-梯度酒精脫水-二甲苯透明-封片程序行蘇木素染色，顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.5免疫組化染色與陽性細胞記數Bcl-2及Bax免疫組化染色采用PV法即免疫組化二步法。切片常規脫蠟；3%H₂O₂室溫孵育15 min；滴加胃酶進行酶修復10 min；滴加Bcl-2和Bax兔抗大鼠多克隆抗體一抗；4 ℃過夜；滴加PV6001二抗，室溫孵育20 min；DAB顯色；蘇木素復染。Bcl-2和Bax陽性染色信號定位于細胞漿，被染成棕黃色或黃褐色顆粒，采用醫學圖像分析系統分析。

1.3.6統計學處理采用SPSS13.0統計軟件處理。計量資料以均數+標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2結果

2.1HE染色觀察細胞假手術組海馬組織結構基本正常，細胞排列整齊緊密，形態正常。高倍鏡下可見神經元細胞核大而圓，透明，有1個~2個明顯的核仁；缺血缺氧組：海馬組織結構疏松，大腦皮層、海馬細胞排列紊亂，且出現空泡、變性和壞死，正常神經元細胞減少；各干預組：各組大腦皮層、海馬細胞變性、壞死明顯減少。

2.2免疫組織化學結果

2.2.1Bcl-2表達Bcl-2陽性細胞廣泛表達于大腦皮層和海馬，為胞漿著色，染色呈棕黃色或黃褐色顆粒。假手術組中Bcl-2蛋白表達較弱，而HIBD組中Bcl-2表達增加，各治療組中Bcl-2表達進一步增加，尤以合用組明顯，差異有統計學意義（P<0.01）。詳見表1。2.2.2Bax的表達Bax陽性細胞主要位于細胞質，染色呈棕黃色顆粒。假手術組中有極少量Bax蛋白表達，HIBD組Bax表達增加，而各治療組中Bax表達下降，尤以合用組明顯，差異有統計學意義（P<0.01）。詳見表2。3討論

腦缺氧缺血后神經元死亡是一種凋亡現象。動物實驗已發現，缺氧缺血性腦損傷后早期就出現凋亡細胞，以皮層、海馬、紋狀體等部位為主，尤以24 h凋亡表達最明顯^［2］。細胞凋亡是涉及多基因調控的復雜主動死亡過程。Bcl-2家族是最主要的凋亡調控基因，在細胞凋亡途徑的上游遠端，構成一個重要的細胞內凋亡調控點^［3-4］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一對調控因子，這兩類分子的比例決定細胞是否發生凋亡。Bcl-2基因是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因，也是迄今研究最廣泛的凋亡調控基因之一。它可以通過多條途徑抑制細胞凋亡，其主要機制可能有:抑制線粒體膜間隙中細胞色素的釋放，從而阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯反應的激活^［5］，抑制活性氧的產生^［6］，抑制鈣離子內流等^［7］。 而促凋亡蛋白(如Bax)則以非活性的形式分布于胞漿中或細胞骨架上，當細胞受到死亡信號刺激后，促凋亡蛋白發生構象變化，從胞漿中轉位至線粒體外膜，并與膜上的抗凋亡蛋白發生相互作用，使抗凋亡蛋白喪失對細胞凋亡的抑制作用，引起線粒體內各種促凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡^［8，9］。

神經節苷脂（Gangliosides，Gg）是一種糖鞘脂，是大多數哺乳動物細胞膜的組成成分，在神經系統中尤為豐富。而單唾液酸四己糖神經節苷脂是哺乳類神經節苷脂的主要種類，它對神經元細胞的分化、生長、軸漿轉運和再生起著重要作用^［10］。GM1的分子結構是由一個疏水的神經酰胺部分和一個親水的唾液酸寡糖基團組成。這種結構特征使其容易與細胞外的信息發生相互反應，影響細胞膜的活動而發揮其生物學功能。GM1作為重要的神經保護劑，新生大鼠腦缺血時外源性GM1可以透過血腦屏障，嵌入受損部位神經細胞膜，阻斷興奮性氨基酸神經毒性，調節細胞膜上Na^-K⁺-ATP酶活性，減少腦組織內Ca²⁺濃度，發揮其抗細胞凋亡作用。張桂蓮等^［11］的實驗證明GM1可使海馬CA1區Bcl-2表達和Bcl-2 /Bax比值增高，從而發揮神經保護作用。

參附注射液已廣泛應用于臨床，在兒科臨床也已有應用^［12］。參附注射液主要成分為人參皂甙（Rb1）和烏頭類生物堿，具有清除氧自由基、抗脂質過氧化、保護內皮細胞作用，保護修復心肌細胞的作用。其對HIE機制可能包括：能抗脂質過氧化反應和促進熱休克蛋白（HSP70）表達 ^［13］。能清除海馬椎體神經元產生的氧自由基，阻滯細胞膜上鈣通道活動，減輕細胞內鈣離子積聚，保護線粒體膜完整性，防止因Ca²⁺過度內流至線粒體膜的去極化，改善神經細胞能量代謝^［14］。可抑制 NF-κB 活化及細胞間黏附分子TNF-α、 IL-10表達，從而起到腦保護作用。提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、增加內源性NO合成、減輕多形核白細胞(PMNs)黏附與聚集，對缺血再灌注損傷具有保護作用。烏頭類生物堿作為β₂受體激動劑，可增強缺氧心肌收縮力，改善心臟微循環^［15］，從而間接改善腦細胞能量代謝等。由此推測參附注射液是通過“多靶效應”起到上調HIE新生大鼠腦組織中Bcl-2蛋白表達及下調Bax蛋白表達，從而減少神經元凋亡。

本實驗證實，新生大鼠缺氧缺血后，聯合使用GM1及參附注射液對其腦損傷的改善效果較兩藥單獨使用更為明顯。推測其機制可能為：在新生大鼠腦缺氧缺血時，兩者可以同時透過血腦屏障，同時發揮其神經保護作用，例如阻斷興奮性氨基酸神經毒性，減少腦組織內Ca²⁺濃度等抗細胞凋亡作用，共同起到上調保護性的基因調控蛋白Bcl-2及下調促凋亡蛋白Bax的表達。初步證明聯合使用GM1及參附注射液對治療新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的療效，確切改善效果及機制有待進一步探討。

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作者簡介：張海嬌（1984—），女，現為山西醫科大學在讀碩士研究生（郵編：030001）；陰懷清（通訊作者）、栗紅、武師潤、陰崇娟，工作于山西醫科大學第一醫院（郵編：030001）。

(收稿日期：2011-01-18)

（本文編輯王雅潔）