PM_2.5不同成分在體染毒對大鼠腎血管環(huán)收縮-舒張反應(yīng)及NOS /NO的影響

摘要：目的探究PM_2.5水溶成分和脂溶成分對大鼠腎動脈收縮-舒張反應(yīng)的影響及其作用機制。方法采用蒸餾水或有機溶劑分別提取PM_2.5的水溶成分和脂溶成分。將大鼠隨機分為3組，分別尾靜脈注射PM_2.5水溶成分、脂溶成分和混合成分，連續(xù)染毒10 d。采用DMT和PowerLab系統(tǒng)記錄大鼠腎動脈血管環(huán)的張力；血清學(xué)檢測大鼠NOS/NO系統(tǒng)變化。結(jié)果與對照組比較，PM_2.5各染毒組加強氯化鉀（KCl）和U46619對腎動脈血管環(huán)的收縮反應(yīng)，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），對乙酰膽堿(Ach)的舒張作用減弱（P<0.05)，對硝普鈉(SNP)的舒張作用無明顯影響。與對照組比，PM_2.5各染毒組的血清NO含量均顯著增高（P<0.05）；混合物染毒組血清eNOS含量顯著降低（P<0.05），而水溶成分組和脂溶成分組無統(tǒng)計學(xué)意義；各染毒組血清iNOS活性均顯著性增高（P<0.05）。結(jié)論PM_2.5水溶成分、脂溶成分及混合成分在體染毒加強KCl和U46619對腎動脈血管環(huán)的收縮反應(yīng)，無統(tǒng)計學(xué)意義；減弱Ach對腎血管環(huán)的舒張效應(yīng)，該作用可能與PM_2.5損傷內(nèi)皮功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞：PM_2.5 腎動脈血管環(huán) 收縮 舒張 NOS/NO

中圖分類號：R544文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0564-03

大氣細(xì)顆粒物(PM_2.5)是指大氣總懸浮顆粒物（TSP）中空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的粒子^［1］。PM_2.5主要產(chǎn)生于交通、制造、能源等行業(yè)中的高溫燃燒過程^［2］。它的形態(tài)和組成相當(dāng)復(fù)雜，含有機成分（如苯并芘等），無機成分如（硫酸鹽、硝酸鹽等），氣態(tài)成分如(NO₂、CO等)及生物成分（如內(nèi)毒素）^［1］。流行病學(xué)研究表明，PM_2.5暴露與呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等多種疾患具有相關(guān)性^［3］。 基礎(chǔ)研究中多通過氣道染毒進行在體實驗，或直接細(xì)胞培養(yǎng)進行干預(yù)實驗。PM_2.5水溶成分在體染毒可加強苯腎上腺素（PE）對大鼠胸主動脈血管環(huán)的收縮作用，減弱乙酰膽堿（Ach）所致的血管舒張作用^［4］。但PM_2.5其他成分在體染毒對心血管系統(tǒng)的損害研究較少，尤其是對小血管舒縮功能的影響研究鮮為報道。同時，PM_2.5暴露對心血管系統(tǒng)損害的機制中，氧化應(yīng)激引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙已成為共識。鑒于此，本實驗采用PM_2.5不同成分在體染毒大鼠，觀察其對腎血管環(huán)舒縮的影響及NOS/NO系統(tǒng)的變化。以期闡明PM_2.5不同成分在體染毒對小血管舒縮活動的影響程度及可能的相關(guān)機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑PM_2.5自太原太鋼地區(qū)采集，血栓素A₂類似物（U46619），Ach，硝普鈉（SNP），4-氨基吡啶（4-AP），HEPES均為Sigma公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）測定試劑盒，血清NO測定試劑盒，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2實驗動物與儀器雄性SD大鼠，約12周，體重250 g～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)條件：每籠5只，自由攝食飲水。鼠飼料由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。合格證號為醫(yī)動字第100314。智能大容量空氣總懸浮顆粒物無碳刷TH -1000C2型大流量采樣器(武漢天虹公司)，玻璃纖維采樣膜(河北省故城縣環(huán)境監(jiān)測器材廠)，四腔小血管環(huán)張力記錄系統(tǒng)為丹麥DMT公司產(chǎn)品。Powerlab生物信號采集分析系統(tǒng)及其張力換能器為澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。HSS-1B數(shù)字式超級恒溫水浴泵為成都儀器廠產(chǎn)品。SZX-1LLB200解剖顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。加樣器為上海求精生化試劑儀器有限公司生產(chǎn)。Sartorius BS124 S 精密天平等。

1.2實驗方法

1.2.1PM_2.5成分提取及溶液配制PM_2.5水溶成分提取及溶液配制，采樣膜超聲振蕩30min~40 min，將濾膜上的顆粒物洗脫下來，取得PM_2.5混懸液，離心，提取上清液將上清液通過三層濾膜。分裝冷凍真空干燥，取得PM_2.5 水溶成分干粉，保存于-20 ℃冰箱。臨用前，稱取一定量的水溶成分干粉，加入去離子水，超聲振蕩混勻，配制成一定濃度的 PM_2.5 水溶成分溶液，在無菌條件下，將溶液通過0.22 μm濾膜于無菌瓶，溶液濃度6 mg/mL，4 ℃保存。

PM_2.5脂溶成分提取及溶液配制，通過索氏提取器，利用二氯甲烷50 ℃水浴下4 h～6 h，提取采樣膜上的PM_2.5脂溶成分。于恒溫水浴（40 ℃）鍋上在風(fēng)廚中蒸干，臨用前，稱取一定量的 PM_2.5脂溶成分干粉，加入純的二甲基亞砜（DMSO），快速混勻器混勻，使其充分溶解，溶液濃度800 μg/mL，DMSO濃度＜0.5％，4 ℃保存。

PM_2.5混合成分溶液配制，將配制好的PM_2.5水溶成分與脂溶成分溶液等容積混合，溶液濃度：水溶成分6 mg/mL+脂溶成分800 μg/mL，4 ℃保存。

1.2.2實驗分組及染毒方法將大鼠隨機分為對照組、水溶成分染毒組、脂溶成分染毒組及混合成分染毒組，每組10只。經(jīng)鼠尾靜脈注射染毒。對照組注射生理鹽水，其余各組分別注射配制好的成分溶液，1 ml/kg，每天染毒一次，共10 d。

1.2.3大鼠腎動脈血管環(huán)的制備染毒10 d后，將大鼠擊頭致昏，立即開腹，經(jīng)腹主動脈抽血后，快速取出腎臟，置于4 ℃ HEPES生理鹽水中。血管環(huán)的制備、張力的記錄方法同文獻(xiàn)［5，6］。所抽血液靜止放置0.5 h后離心，提取血清分裝冷凍以備血清學(xué)檢測。

1.2.4大鼠腎動脈血管環(huán)舒縮變化的測定血管環(huán)穩(wěn)定2 h后，向浴管中加入KCl（60 mmol/L），當(dāng)連續(xù)兩次同樣的刺激所

1)為山西省自然科學(xué)基金資助項目（No.2010011055-2）

引起的收縮幅度差別＜5％時，在此基礎(chǔ)上Ach 10^-5 mol/L所引起的舒張幅度≥30％時，認(rèn)為血管活性良好。用新鮮的正常HEPES生理鹽水沖洗標(biāo)本3次，30 min后加入U46619（3×10^-5 mmol/L），以收縮達(dá)平臺穩(wěn)定后為最大收縮值。

在KCl（60 mmol/L）、U46619（3×10^-7 mmol/L）預(yù)收縮平穩(wěn)的基礎(chǔ)上，分別向浴管中加入不同濃度Ach（10^-9～10^-5 mol/L），SNP（10^-9～10^-5 mol/L）。觀察在體染毒對大鼠腎動脈血管環(huán)舒張的影響。

1.2.5大鼠血清eNOS、NO含量及iNOS活性的測定采用ELISA測定血清內(nèi)皮型eNOS含量。采用硝酸還原酶法測定血清NO含量。比色法測定血清誘導(dǎo)型iNOS活性。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，單因素方差及配對t檢驗分析。

2結(jié)果

2.1PM_2.5各染毒組加強KCl和U46619對腎動脈血管環(huán)的收縮反應(yīng)（見圖1）。

圖1PM_2.5各染毒組對KCl和U46619收縮反應(yīng)柱狀圖

2.2PM_2.5各染毒組減弱乙酰膽堿對腎動脈血管環(huán)的舒張作用 （見圖2）。 圖2PM_2.5各染毒組對乙酰膽堿舒張作用曲線圖

2.3PM_2.5各染毒組減弱硝普鈉對腎動脈血管環(huán)的舒張作用（見圖3）。

圖3PM_2.5各染毒組對硝普鈉舒張作用曲線圖

2.4PM_2.5各染毒組對大鼠血清NO含量的影響（見圖4）

圖4PM_2.5各染毒組血清NO含量柱狀圖

2.5混合成分染毒組大鼠血清eNOS含量（見圖5）

圖5PM_2.5各染毒組血清eNOS含量柱狀圖

2.6PM_2.5各染毒組大鼠血清iNOS活性（見圖6）

圖6PM_2.5各染毒組血清iNOS含量柱狀圖

3討論

在PM_2.5水溶成分急性鼠尾靜脈染毒1 h和6 h后，血清NO含量減少，eNOS含量不變，iNOS活性增高。本實驗通過PM_2.5水溶成分、脂溶成分和混合成分連續(xù)10 d鼠尾靜脈染毒后，與對照組相比，PM_2.5各染毒組無明顯加強KCl和U46619對腎動脈血管環(huán)的收縮反應(yīng)，但減弱Ach對腎血管環(huán)的舒張作用；各染毒組血清NO含量，血清iNOS活性均顯著增高，混合成分染毒組血清eNOS含量減少。Ach對腎血管環(huán)舒張是依賴內(nèi)皮的，提示連續(xù)10 d染毒可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損。NO是血管系統(tǒng)重要的保護因子，其活性的下降是許多心血管疾病發(fā)生的最重要因素之一；但在某些情況下，NO又對人體有害。它本質(zhì)上是一種自由基，在人體內(nèi)的半衰期很短，產(chǎn)生后迅速與氧合血紅蛋白、超氧陰離子(O^2-)反應(yīng)而失去生理活性，產(chǎn)生較強的細(xì)胞毒作用^［7］，考慮血清NO含量，血清iNOS活性均顯著增高的機制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

大氣細(xì)顆粒物成分在體染毒減弱Ach對大鼠腎血管環(huán)的舒張作用，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，NOS/NO系表達(dá)異常是其可能的相關(guān)機制。

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作者簡介：孫萌（1985—），女，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學(xué)2008級心血管內(nèi)科碩士研究生（郵編：030001）；呂吉元（通訊作者）、張涌，工作于山西醫(yī)科大學(xué)（郵編：030001）；張明升，工作于山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室；龐衛(wèi)乾，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學(xué)2010級在讀碩士研究生。

（收稿日期：2011-03-01）

（本文編輯王雅潔）