高原環(huán)境下REM睡眠剝奪大鼠皮質(zhì)GRP78的表達(dá)及藥物干預(yù)

摘要：目的探討高原環(huán)境下大鼠不同時(shí)間快速動眼睡眠（REM）期睡眠剝奪（SD）后皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)控蛋白78（GRP78）的動態(tài)變化、神經(jīng)元凋亡影響及人參皂甙Rd（GS Rd）可能的神經(jīng)保護(hù)作用。方法采用小平臺水環(huán)境法制作大鼠SD模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測相關(guān)時(shí)間點(diǎn)GRP78的動態(tài)變化；TUNEL試劑盒檢測凋亡細(xì)胞。結(jié)果在平原（蘭州）組，SD后1 d皮層區(qū)GRP78蛋白表達(dá)開始增高，3 d時(shí)達(dá)高峰，5 d時(shí)與正常睡眠組相比無明顯差別。GS Rd，組SD后1 d、3 d、5 d GRP78的表達(dá)較生理鹽水對照組增高。在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)高原（可可西里）組GRP78的表達(dá)均高于平原組。結(jié)論高原SD組大鼠GRP78的表達(dá)較平原組增高；GS Rd能夠提高SD組大鼠GRP78表達(dá)；GS Rd可能會通過升高GRP78的表達(dá)保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，以減輕腦損傷。

關(guān)鍵詞：高原 睡眠剝奪 葡萄糖調(diào)控蛋白78 皮層 人參皂甙Rd

中圖分類號：R741文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0591-02

Expression of GRP78 in Rats with Sleep Deprivation during High-altitude Environment and Intervention

Ma Yajie，Yang Jinsheng，Yang Xiao，et al

The Second Clinical Medical College，Lanzhou University(Lanzhou 730050)

Abstract:ObjectiveTo investigate the dynamic expression of endoplasmic reticulum stress（ERS）GRP78，neuron apoptosis in the rat cerebral contex at different stages of REM sleep deprivation in high altitude environment，and the possible neural protective effect of ginsenoside Rd.MethodsThe sleep deprivation of Wistar rats was induced by employing“flower pot”technique.Expression of GRP78 protein was check with immunohistochemistry staining.Apoptosis cell was studied with TUNEL.ResultsImmunohistochemistry staining results showed that the expressions of GRP78 protein was increased after one day of REM sleep deprivation compared with that in rats with normal sleep in plain group（Lanzhou group） and reached the highest on the normal sleep group.After intervention of ginsenoside Rd，the expression of GRP78 was higher than physiological saline groups after first or third day of REM sleep deprivation.The expression of GRP78 protein was not different from physiological saline groups on the fifth day.At the same time the expression of GRP78 protein in plateau group（Kekexili group） was higher compared with plain group.ConclusionThe expression of GRP78 protein was higher in plateau compared with plain groups.Ginsenoside Rd could increase expression of GRP78 protein.Ginsenoside Rd might lessen brain injuries by increasing expression of GRP78.

Key words:plateau；sleep deprivation；GRP78；cerebral contex；ginsenoside Rd

葡萄糖調(diào)控蛋白（glucose regulated protein 78kD，GRP78）又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Bip），屬于熱休克蛋白70家族的成員^［1］，主要存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽聚集、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡等作用，發(fā)揮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保護(hù)功能^［2，3］。人參皂甙Rd（GS Rd）是人參的主要有效成分，具有抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)作用，已經(jīng)進(jìn)入臨床三期試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)觀察高原環(huán)境下GS Rd干預(yù)組SD大鼠皮層GRP78表達(dá)的變化，探討GS Rd對SD損傷大鼠的可能神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑成年Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重180 g~300 g，由甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。GRP78一抗、二抗，由北京博奧森科技公司提供，TUNEL試劑盒，購自Roche公司。

1.2動物模型的建立采用小平臺水環(huán)境法建立SD模型，參照相關(guān)文獻(xiàn)制作剝奪箱體積為30×30×30 cm³，中央置一直徑為6.5 m，高8 cm的平臺。若大鼠進(jìn)入快速動眼（REM）睡眠，則由于肌肉張力松弛而落入水中，并迅速爬上平臺，不斷重復(fù)此過程造成REM的剝奪。正常對照組單獨(dú)籠養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.3動物分組與給藥70只大鼠隨機(jī)分為兩組，平原組（蘭州組）和高原組（可可西里組）。每組又分正常睡眠組GS Rd干預(yù)組（GS Rd 1 d、3 d、5 d）和生理鹽水對照組（NS1 d、3 d、5 d）。剔除溺水和意外死亡后隨機(jī)補(bǔ)充以滿足每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為5只大鼠。GS Rd由廣東泰禾生物藥業(yè)有限公司提供（每支10 mg），GS Rd組大鼠于實(shí)驗(yàn)開始前7 d腹腔注射GS Rd（2 mg/kg ），1次/天。相應(yīng)對照組予以等劑量生理鹽水腹腔注射。

1.4HE染色腦標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定24 h，對大腦皮層組織進(jìn)行脫水、 透明、 浸蠟、 包埋、 切片。

1.5免疫組織化學(xué)染色采用SABC法，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；用DPcontroller 70/OlympusBX61顯微攝影分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集（由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心協(xié)助完成），光鏡下于每一張切片隨機(jī)取5個(gè)視野采集圖像。免疫組化圖像采用Image-Pro plus 6.0分析軟件進(jìn)行分析，測量每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取算術(shù)平均數(shù)作為該例的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6凋亡細(xì)胞檢測經(jīng)北京中科通用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(GMIAS2.0)處理，每只大鼠選取5張切片，每片隨機(jī)取3個(gè)視野，以陽性染色細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ²檢驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)、用方差分析。SPSS11.0軟件分析。

2結(jié)果

2.1HE染色光鏡下可見，蘭州組正常睡眠組大鼠皮層細(xì)胞排列整齊，胞漿豐富，核呈圓形，居中。高可可西里組正常睡眠組大鼠皮層細(xì)胞排列稍紊亂，細(xì)胞輪廓稍模糊。SD組大鼠皮層區(qū)腦組織疏松淡然，結(jié)構(gòu)排列紊亂，數(shù)目減少，體積變小，胞質(zhì)濃縮，胞核固縮；GS Rd干預(yù)組神經(jīng)元數(shù)目增多，細(xì)胞輪廓較清晰。

2.2免疫組織化學(xué)染色GRP78免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色顆粒，分布于胞漿及胞核。蘭州生理鹽水對照組SD1 d后GRP78表達(dá)開始增多(P<0.05)，至SD3 d時(shí)達(dá)高峰(P<0.05)，至5 d與正常睡眠組無差別；GS Rd預(yù)先干預(yù)組SD1 d、3 d時(shí)GRP78表達(dá)均較生理鹽水1 d、3 d組增高(P<0.05)；與蘭州組比較，在各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)可可西里組GRP78表達(dá)均高于蘭州組(P<0.05)。詳見表1、表2。

2.3TUNEL染色蘭州組大鼠SD1 d、3 d皮質(zhì)區(qū)可見凋亡細(xì)胞，核呈棕黃色顆粒；在SD5 d、GS Rd預(yù)先干預(yù)組及正常睡眠組均未見明顯陽性細(xì)胞。SD后1 d、3 d皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡分別為(19.10±1.87、22.50±2.01)，SD1 d、3 d皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)和正常睡眠組同區(qū)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而SD5 d與正常睡眠組同區(qū)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可可西里組SD1 d、3 d皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(21.16±3.12、24.35±3.01)，與蘭州組比較，各時(shí)間點(diǎn)可可西里組凋亡細(xì)胞較蘭州組明顯(P<0.05)。

3討論

GRP78位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特異性標(biāo)志。當(dāng)組織發(fā)生缺血、缺氧、細(xì)胞代謝紊亂時(shí)，導(dǎo)致GRP78大量表達(dá)，足量表達(dá)的GRP78，與細(xì)胞內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白結(jié)合，通過恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，保證應(yīng)激情況下蛋白合成，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定^［4，5］。

SD可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，長期SD可造成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變^［6］，發(fā)生細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。細(xì)胞凋亡是SD導(dǎo)致神經(jīng)元損傷死亡的一種重要形式。通過某些藥物干預(yù)細(xì)胞凋亡通路，可以使神經(jīng)元細(xì)胞免受損傷，為此，選擇中藥GS Rd進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性研究。

GS Rd是從中藥人參、三七中提取的化合物，其通透性高，可以透過血腦屏障。GS Rd具有抗腫瘤^［7］、抗變態(tài)反應(yīng)^［8］、抗骨質(zhì)疏松^［9］等多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究主要探討GS Rd的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選擇2 mg/kg為給藥劑量，每日給藥1次，連續(xù)用藥7 d，給藥完畢后即進(jìn)行SD。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，蘭州組SD1d后大鼠的皮層區(qū)GRP78表達(dá)開始升高，提示SD引起細(xì)胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。隨著SD時(shí)間的延長，GRP78表達(dá)逐漸增高，至第3天達(dá)高峰，此時(shí)未折疊蛋白反應(yīng)能力最強(qiáng)，細(xì)胞由自身調(diào)節(jié)逐漸轉(zhuǎn)向凋亡，TUNEL染色可見SD3 d 時(shí)凋亡細(xì)胞最多，也與免疫組化相一致。至SD5d GRP78的表達(dá)較正常睡眠組相比未見明顯差異，可能與此時(shí)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生蛋白合成功能障礙有關(guān)。可可西里SD組GRP78的表達(dá)較蘭州組增高，表明在缺氧、強(qiáng)輻射等高原暴露因素的參與下，加劇了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。藥物GS Rd干預(yù)組大鼠GRP78的表達(dá)水平較生理鹽水組增加，GS Rd可能是通過促進(jìn)GRP78的表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，減輕SD造成的腦損傷，可以為具有一定可預(yù)見性的腦損傷保護(hù)提供一個(gè)新的選擇。

SD后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，涉及Ca²⁺超載、能量衰竭、自由基釋放、線粒體損傷、興奮性氨基酸毒性作用等。GS Rd是一種非特異性Ca²⁺通道阻斷劑，能非選擇性阻斷受體依賴性Ca²⁺通道開放，抑制胞外Ca²⁺內(nèi)流和胞漿Ca²⁺升高，抑制Na⁺-Ca²⁺交換，防止胞內(nèi)Ca²⁺超載。另外GS Rd具有抗氧化損傷、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫，擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能恢復(fù)、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)等多種藥理作用，也可能參與低氧及SD后腦損傷的保護(hù)作用。

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作者簡介：馬亞杰(1982—)，男，碩士研究生，現(xiàn)工作于蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（郵編：730050）；楊金升、石向群、鄭佳麗、劉學(xué)娟，工作于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院；楊曉，工作于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院。

(收稿日期：2011-01-10）

(本文編輯王雅潔）