甘精\\地特和人胰島素對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響

摘要:目的觀察甘精、地特和人胰島素對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響。方法用甘精、地特和人胰島素干預3T3-L1前脂肪細胞，并用MTT和油紅O染色法測定其增殖和分化水平。結果甘精胰島素(1.013±0.007)可促進前脂肪細胞增殖，地特胰島素(0.990±0.009)可抑制前脂肪細胞增殖；胰島素為前脂肪細胞分化的必須成分，促分化作用人胰島素(0.638±0.006)最強，甘精胰島素(純品0.623±0.007，液體0.445±0.006)次之，地特胰島素(0.412±0.006)最弱。結論不同胰島素對前脂肪細胞增殖分化的影響不同。

關鍵詞：胰島素 前脂肪細胞 增殖 分化

中圖分類號：R255.4R587.1文獻標識碼：B文章編號：1672-1349(2011)05-0545-02

糖尿病的發病率呈現快速增長，胰島素是糖尿病治療中不可替代的藥物。胰島素的發展經歷了動物胰島素、基因工程人胰島素和胰島素類似物三個階段。甘精胰島素和地特胰島素作為胰島素類似物出現，已廣泛應用于臨床^［1］。脂肪組織是胰島素的重要靶器官之一，前脂肪細胞具增殖能力，且能分化為脂肪細胞，作用持續于人的一生，其增殖和分化能力影響脂肪組織的構建。本文擬比較甘精、地特和人胰島素對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化的影響，從而指導臨床選擇不同的胰島素對糖尿病患者進行個體化治療。

1資料與方法

1.1主要實驗用品及化學試劑DMEM-F12培養基、胰蛋白酶購自Gibco-BRL公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；青霉素、鏈霉素購自華北制藥廠；噻唑蘭、二甲基亞砜、人胰島素、甲狀腺素、地塞米松、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤均購自Sigma公司；油紅O染料購自Amersco公司；地特胰島素由諾和諾德公司提供；甘精胰島素液體和純品由甘李藥業有限公司提供。

1.2試驗方法

1.2.13T3-L1前脂肪細胞的復蘇準備37 ℃的溫水，從液氮罐中取出凍存管，迅速投入溫水中。在水中來回晃凍存管1 min左右，觀察到凍存液基本融化。將凍存管中液體吸入離心管中，1 000/min離心5 min，吸棄上清，加入新的培養基，吹打均勻，使得細胞分散，以10⁴/mL密度接種，放入CO₂培養箱中培養。

1.2.2MTT法觀察前脂肪細胞增殖前脂肪細胞以10⁴/mL接種于96孔板，37℃、5%CO₂培養24 h后，設對照組(含10%胎牛血清的D-MEM/F-12配制的完全培養液)和四組干預組(含10 nmol/L甘精純品胰島素、人純品胰島素、甘精液體胰島素、地特液體胰島素的完全培養液)孵育細胞，隔日一次倒置顯微鏡下觀察細胞并作MTT比色法測增殖。

1.2.3前脂肪細胞分化過程觀察前脂肪細胞以10⁴/mL接種于96孔板，D-MEM/F-12(1∶1)基礎培養基中添加0.25 μmol/L胰島素、0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲狀腺素以及0.5 mmol/L IBMX作分化培養基誘導分化，設對照組(不含胰島素)和四組干預組(含0.25 μmol/L甘精純品胰島素、人純品胰島素、甘精液體胰島素、地特液體胰島素的分化培養液)，3 d后改用不含IBMX的分化培養基誘導直至14 d，隔日一次顯微鏡觀察。用油紅O染色和異丙醇抽提的方法進行細胞內脂質含量定量(以OD值表示)。

1.3統計學處理數據以均數±標準差(x±s)表示，用SPSS 13.0統計學軟件處理。多組間應用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗。

2結果

2.1不同胰島素對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響3T3-L1前脂肪細胞在接種16 h左右基本完全貼壁，顯微鏡下觀察形態類似于成纖維細胞，呈棱形、梭形或多角形，細胞核圓形，位于細胞質中央，使用油紅O染色完全不能著色。接種后的第4天進入對數增長期，第10天進入增殖平臺期。8 d時地特液體胰島素抑制細胞的增殖(P<0.05)。10 d時甘精純品胰島素(P<0.05)、甘精液體胰島素(P<0.05)促進細胞的增殖，地特液體胰島素抑制細胞的增殖(P<0.05)。12 d時地特液體胰島素抑制細胞的增殖(P<0.05)。詳見表1。2.2不同胰島素對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響當前脂肪細胞生長達接觸抑制后，以分化培養基可誘導前脂肪細胞分化。前脂肪細胞分化為脂肪細胞后，胞質內可以觀察到脂質小滴，并隨著分化的進展，胞質內的脂滴迅速增多且多散在，使細胞的形態由多角形變為橢圓形或圓形，油紅O可染色。誘導前脂肪細胞分化至第2天時細胞體積開始變大，第4天開始胞質內可以觀察到脂質小滴。隨分化進程細胞內脂質聚集逐漸增多，4 d到10 d增長迅速，12 d達高峰。對照組為不含胰島素的分化培養基，只有小部分細胞自行分化，12 d之內無明顯變化。前4 d，各干預組間差異無統計學意義(P>0.05)。6 d開始，甘精液體胰島素與地特液體胰島素對前脂肪細胞分化影響的差別有統計學意義(P<0.05)，地特胰島素促前脂肪細胞分化的能力弱于甘精胰島素。8 d時，人胰島素促前脂肪細胞分化的能力強于甘精胰島素(P<0.05)，地特胰島素仍弱于甘精胰島素。詳見表2。3討論

人胰島素為胰腺β細胞合成和分泌的一種多肽激素，由A鏈和B鏈組成，A鏈含有2 1個氨基酸殘基，B鏈含有30個氨基酸殘基。甘精胰島素是合成的人胰島素類似物，對結構的改進是將人胰島素A鏈21位由甘氨酸取代天冬氨酸，B鏈末端增加2個精氨酸^［2］。地特胰島素是一種中性的、可溶的、長效胰島素類似物，它是通過去掉胰島素肽鏈上B30位的蘇氨酸并通過酰化作用在B29位的賴氨酸上結合了一個14碳的脂肪酸(肉豆蔻酸)而形成^［3］。

在增殖實驗中，到第8天時地特液體胰島素開始抑制細胞的增殖直到第12天，第10天時甘精胰島素促進細胞的增殖。Slieker 等^［4］實驗表明胰島素B26-B30 分子結構的改變會影響與IGF-IR 的親和力，最終影響胰島素促進有絲分裂的能力。甘精胰島素因為B鏈分子結構的改變使其促有絲分裂的能力強于其他胰島素。Ashish等^［6］在觀察不同胰島素對MCF7(乳腺癌細胞)增殖的影響時得出結論，在甘精胰島素濃度為1.5 nmol/L～1.5 mmol/L時能明顯促進細胞增殖，而地特胰島素濃度在15 nmol/L～1.5 mmol/L時促增殖作用弱于人胰島素。Mayer等^［7］實驗表明含甘精胰島素的血清對MCF7促增殖作用是含人胰島素血清的1.11倍，而含地特胰島素的血清為含人胰島素血清的0.99倍，這與本文得出的結論相似。

在觀察不同胰島素對前脂肪細胞分化影響的實驗中，可以看到胰島素為前脂肪細胞分化的必須試劑，在不含胰島素的培養基中前脂肪細胞基本不分化。此外，人胰島素促進前脂肪細胞分化的能力最強，甘精胰島素次之，地特胰島素最弱。胰島素促進脂肪細胞分化是通過包含一系列胰島素受體底物(IRSs)的信號網絡實現的。最早發現體外培養前脂肪細胞的分化需要胰島素，胰島素可以提高前脂肪細胞的分化率，胰島素在前脂肪細胞轉化中起相當重要的作用^［8］。Kristensen等^［9］實驗表明胰島素分子結構的改變會影響與胰島素受體的結合力，從而影響代謝能力。Peter等^［5］也得出結論，人胰島素與受體結合的能力最強，甘精稍弱，地特的結合能力最差，這可能與其促分化能力不同有關。Staiger 等^［10］做出的實驗表明小劑量的人胰島素即可促進前脂肪細胞分化，這與本文結論相似。Anja 等^［11］得出結論地特胰島素小劑量和大劑量對前脂肪細胞分化的影響都低于小劑量的人胰島素，這與本文結論一致；同時，地特胰島素對前脂肪細胞分化的影響并非由于B29位結合的肉豆蔻酸改變信號轉導通路造成的，機制尚不明確。

參考文獻:

［1］Jeffrey SF，DO.Insulin Analog Therapy:Improving the match with physiologic Insulin secretion［Ｊ］.J Am Osteopath Assoc，2009，109:26-36.

［2］Andreas T，Mario T，Philippe D，et al.Mass spectrometric identification of degradation products of insulin and its long-acting analogues in human urine for doping control purposes［Ｊ］.Anal Chem，2007，79，2518 -2524.

［3］YaredND，NaveedY，Handrean S.Therole ofinsulindetemir in overweight type 2 diabetes management［Ｊ］.Vascular Health and Risk Management，2009，5：553-560.

［4］Slieker LJ，Brooke GS，Dimarchi RD，et al.Modifications in the B10 and B26-30 regions of the B chain of human insulin alter affinity for the human IGF-I receptor more than for the insulin receptor［Ｊ］.Diabetologia，1997，40:S54-S61.

［5］Ashish S，Jean G，Volker E，et al.Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines［Ｊ］.Endocrine Related Cancer，2009，16:429-441.

［6］Mayer D，Chantelau E.Treatment with insulin glargine(Lantus) increases the proliferative potency of the serum of patients with type-1 diabetes:A pilot study on MCF-7 breast cancer cells［Ｊ］.Arch Physiol Bioche，2010，116(2):73-78.

［7］Kristensen C，Kjeldsen T，Wiberg FC，et al.Alanine scanning mutagenesis of insulin［Ｊ］.J Biol Chem，1997，1272(20):12978-12983.

［8］The role of PDGF-dependent suppression of apoptosis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes［Ｊ］.Eur J Cell Biol，1998，77(3):220-227.

作者簡介：盧婷(1986—)，女，為山西醫科大學第一醫院內分泌科在讀碩士研究生(郵編：030001)；楊靜(通訊作者)，工作于山西醫科大學第一醫院(郵編：030001)。

(收稿日期：2010-11-18)

(本文編輯王雅潔)