依達拉奉對大鼠癲癇持續狀態神經元細胞凋亡的影響

摘要：目的研究自由基清除劑依達拉奉對大鼠癲癇持續狀態（SE）后神經元細胞凋亡的影響。方法采用氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇持續狀態模型，實驗Wistar大鼠隨機分為實驗組（72只）和對照組(C組，6只），實驗組分為模型組（M組）、依達拉奉單藥治療組(ED組)、聯合地西泮治療組（ED+DI），每組按照時間點分為4個亞組（12 h、24 h、72 h、7 d）。免疫組化法檢測大鼠腦組織的Bcl-2蛋白表達，及TUNEL法檢測細胞凋亡的情況。結果Bcl-2蛋白表達與對照組相比，M組12 h達高峰，24 h開始減少， 7 d減至基礎水平（P<0.05）。而依達拉奉單藥和聯合地西泮治療組與之比較，變化趨勢相同但Bcl-2表達增多（P<0.05）；M組TUNEL染色陽性細胞極多，12 h開始上升，48 h達高峰，之后有下降趨勢（P<0.01）。ED組TUNEL染色陽性細胞數值變化趨勢相同但低于M組（P<0.01），高于ED+DI組；ED+DI組與C相比仍有統計學意義（P<0.05）。結論依達拉奉對氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇持續狀態所致腦損傷具有保護作用，其機制可能通過清除自由基上調Bcl-2蛋白表達及減少神經元細胞凋亡，聯合地西泮治療效果更顯著。

關鍵詞：依達拉奉 癲癇持續狀態 Bcl-2 神經元凋亡

中圖分類號：R742.1R255文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0585-02

本實驗擬采用依達拉奉及與地西泮聯合治療觀察其對癲癇持續狀態神經元細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料清潔級健康成年雄性Wistar大鼠，體重200 g～250 g，由山西醫科大學生理教研室動物中心提供；氯化鋰購自中國醫藥集團上海試劑公司;匹羅卡品購自美國Sigma公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒均系武漢博士德公司產品;DAB試劑由北京中杉金橋生物技術有限公司出品;依達拉奉系江蘇南京先聲藥業有限公司生產。

1.2方法

1.2.1動物分組78只Wistar大鼠隨機分為實驗組（72只）和對照組（C組，6只），實驗組分為模型組（M組）、依達拉奉單藥治療組(ED組)、聯合地西泮治療組（ED+DI），每組按照時間點分為4個亞組（12 h、24 h、72 h、7 d）。實驗動物飼養于正常晝夜環境中，給予標準飼料及飲水。

1.2.2動物模型制備氯化鋰-匹羅卡品癲癇持續狀態模型制作，腹腔注射氯化鋰3 mEq/kg，20 h后再腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30 mg/kg。對照組大鼠給予生理鹽水腹腔注射。大鼠在15 min~45 min出現反復強直-陣攣發作，形成癲癇持續狀態。按照經典的Racine癲癇發作行為標準進行癲癇行為觀察記錄。實驗組動物發作級別均達到Ⅳ級～Ⅴ級以上提示造模成功。干預組大鼠在癲癇發作后1 h腹腔注射依達拉奉20 mg/kg，聯合治療組同時腹腔注射地西泮10 mg/kg，隨機分為按照發作后12 h、24 h、72 h、7 d再分為實驗組4個亞組。

1.3標本采集與處理實驗組大鼠分別在癲癇持續狀態發作后12 h、24 h、72 h、7 d與對照組大鼠，用5％水合氯醛按5 ml/kg腹腔注射麻醉，斷頭取腦。大鼠腦組織在4％的多聚甲醛中固定24 h，經石蠟包埋后，在海馬部位作矢狀位切片，片厚約5μm。HE染色，光鏡下觀察形態學變化。

1.3.1Bcl-2蛋白免疫組化染色按照常規SABC法進行免疫組化檢測，DAB顯色，蘇木精輕度復染。每張切片取5個視野（×400倍），測定每個視野的陽性細胞數，取其平均值。

1.3.2TUNEL染色以不加TdT酶作為陰性對照，細胞核染成棕褐色的為凋亡陽性細胞。每張切片取5個視野（×400倍），計數每個視野的陽性細胞數，取其平均值。

1.3.3圖像分析采用Mias(2000型)圖像分析系統對海馬及海馬皮層Bcl-2蛋白、TUNEL陽性細胞進行定量計數。

1.4統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行處理。檢測結果以均數±標準差(x±s)表示。多樣本均數比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2結果

2.1行為學觀察正常對照組未出現癲癇發作。實驗組大鼠在給予匹羅卡品后15min～30 min均出現洗臉樣動作、節律性咀嚼、點頭等面部痙攣樣動作；隨后出現前肢陣攣，之后很快表現為前肢陣攣伴站立，進一步發展到全身強直陣攣發作伴站立、摔倒，反復發作，達到癲癇持續狀態。實驗組大鼠成功72只，成功率 92.3％，死亡2只，并隨機補充。

2.2HE 染色結果正常對照組神經元排列整齊緊密，細胞呈圓形或橢圓形，胞漿透明且染色質分布均，核仁清晰；模型組出現了嗜酸性神經元，表現為細胞排列紊亂，胞體收縮明顯，胞漿紅染，胞核固縮；依達拉奉組也出現嗜酸性神經元，但數量較少，細胞排列松散；聯合治療組嗜酸性神經元極少，但細胞排列尚整齊，形態接近于正常。

2.3Bcl-2蛋白的表達情況細胞漿及核膜內出現黃色或棕黃色樣物質為Bcl-2陽性細胞。每張切片取5×400倍視野，計數每個視野的陽性細胞數，取其平均值。C組有基礎量的Bcl-2蛋白表達。與對照組相比，M組Bcl-2蛋白表達12 h達高峰，24 h開始減少，48 h繼續減低，72 h到7 d減至基礎水平（P<0.05）。ED組大鼠Bcl-2蛋白表達在12 h最高，24 h、48 h逐漸減少，7 d時仍高于M組（P<0.05）。ED+DI的Bcl-2蛋白表達與ED組趨勢相同，但均高于ED組（P<0.05）。詳見表1。

2.4TUNEL染色結果TUNEL染色陽性細胞即凋亡細胞，主要表達在神經元及神經膠質細胞，表現為胞核中出現棕色顆粒，固縮聚集在核膜周邊，呈典型的指環狀或新月狀的凋亡特征。M組TUNEL染色陽性細胞表達水平在12 h開始上升，48 h達高峰，之后有下降趨勢（P<0.01）。ED組TUNEL染色陽性細胞數值變化趨勢相同但低于M組（P<0.01），高于ED+DI組；ED+DI組與C相比仍有差別（P<0.05）。詳見表2。

1）為山西醫科大學第二醫院院青年基金資助（No.20090202）

3討論

癲癇對神經系統的損害并非隨放電的終止而停止，一次癲癇急性發作就足以引起腦部特定區域神經元的脫失^［1，2］，且損傷程度與發作別相關^［3］。癲癇時伴有非常活躍的自由基活動^［4，5］。自由基在癲癇損傷機制可能通過以下幾點： 自由基的神經毒性作用，在癲癇急性發作病理過程中，大腦內過量產生的自由基通過滅活谷氨酰胺合成酶來促進興奮性神經遞質谷氨酸的異常增加，促進癲癇發生、發展；自由基使細胞膜離子通透性增加，使Ca²⁺內流增加，導致進行性去極化，引起神經細胞異常放電；自由基參與了癲癇發病病理過程，通過增加膜脂質過氧化以及減少致癇灶GSH-PX水平，引起神經元變性； 自由基與神經細胞損傷密切相關，是造成細胞死亡的原因之一，通過保護自由基所造成的破壞就可以減少癲癇發作所致細胞死亡^［6］。

依達拉奉預處理癲癇動物模型后觀察到，可以減少癲癇發作后的神經元凋亡，機制可能通過上調IRE1(the inositol requiring enzyme 1) 的表達及維持其活性以緩解內質網壓力；依達拉奉可以通過拮抗氧自由基并抑制谷氨酸釋放，在癲癇發作中發揮保護作用^［7］；可顯著緩解紅藻氨酸致癇大鼠谷胱甘肽降低和4-hydroxy-2-nonenal（HNE)升高，依達拉奉神經保護效果是通過抑制脂質過氧化實現的^［8］，但是高劑量依達拉奉(20 mg/kg)延遲點燃發展，縮短后放電持續時間和提高后放電閾值。這些數據顯示該劑量的依達拉奉通過阻止癲癇發揮抗癲癇效果^［9］。

癲癇持續狀態發生時候患者不大可能在發作前接受干預性治療，所以如果在癲癇發作后給予依達拉奉可以阻止神經元的丟失將是一大優勢。故本實驗選用依達拉奉在癲癇發作后給藥，觀察其對海馬神經元凋亡的影響。Bcl-2家族在癲癇細胞凋亡過程中作用主要是抑制細胞凋亡。Bcl-2蛋白位于線粒體膜或核膜及溶酶體膜的膜蛋白，可以通過多種途徑有效抑制細胞凋亡的發生。

本實驗中觀察到，應用依達拉奉后大鼠海馬局部Bcl-2蛋白表達增加，TUNEL染色陽性細胞減少。依達拉奉治療組低于模型組，但高于聯合治療組；聯合治療組與空白對照組相比仍有差別。依達拉奉可以減少癲癇持續狀態后的神經元凋亡，可能通過清除自由基起到一定的腦保護作用。在癲癇發作后及時給予自由基清除劑可減輕癲癇發作所造成的腦損傷，可以有效減少癲癇持續狀態神經元細胞凋亡，為臨床輔助治療癲癇提供進一步的支持證據。與管得寧等^［10］的臨床研究結果相符，依達拉奉可顯著改善患者預后。

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［10］管得寧，徐運，王鐘翀.依達拉奉輔助治療難治性癲痛的療效及機制［Ｊ］.中風與神經疾病雜志，2007，24，(3):358-359.

作者簡介：薛國芳（1976—），女，主治醫師，現工作于山西醫科大學第二醫院（郵編：030001）；鄭輯英（通訊作者）、李光來、李東芳、王改青、陳文軍，工作于山西醫科大學第二醫院（郵編：030001）；牛海雁，工作于山西省長治市人民醫院； 齊登斌，為山西醫科大學2008級神經內科碩士研究生。

(收稿日期：2011-01-22)

（本文編輯王雅潔）