ERK在偏頭痛動物模型中的激活及與肥大細胞脫顆粒間的關系

摘要：目的觀察皮下注射硝酸甘油（GTN）誘導大鼠偏頭痛模型中硬腦膜、三叉神經核尾部磷酸化ERK（p-ERK）的表達，及p-ERK表達與肥大細胞脫顆粒間的關系。方法24只雄性SD大鼠隨機分為偏頭痛模型組（n=18）和空白對照組（n=6）。模型組采用皮下注射GTN（10 mg/kg）法建立大鼠偏頭痛模型，再將模型組大鼠隨機分為3個亞組：C48/80組（腹腔注射C48/80，2 mg/kg）；SCG+ C48/80組（腹腔先注射SCG 10 mg/kg后再注射C48/80 2 mg/kg）和實驗對照組（腹腔注射同等劑量的生理鹽水）；空白對照組大鼠皮下注射等量生理鹽水。模型組和空白對照組分別于15 min取硬腦膜和三叉神經核尾部。用免疫組織化學染色觀察大鼠硬腦膜和三叉神經核尾部磷酸化ERK（p-ERK）的表達。結果ERK在模型組各亞組和空白對照組的硬腦膜和三叉神經核尾部都發生了磷酸化，但模型組各亞組p-ERK陽性免疫反應產物都明顯高于空白對照組（P<0.05），且C48/80組高于SCG+ C48/80組和實驗對照組（P<0.05）。結論皮下注射GTN致大鼠偏頭痛發作后，大鼠硬腦膜和三叉神經核尾部處p-ERK的表達增加，且隨肥大細胞脫顆粒的多少而發生變化，提示ERK可能參與了偏頭痛痛覺信號的傳導，肥大細胞脫顆粒可能是促使p-ERK表達增加的原因，p-ERK在偏頭痛的發病機制中發揮重要的作用。

關鍵詞：偏頭痛 細胞外信號調節激酶 肥大細胞 硬腦膜 三叉神經核尾部 硝酸甘油 大鼠

中圖分類號：R747.2R255文獻標識碼：A文章編號：1672-1349(2011)05-0587-03

偏頭痛是一種反復發作的原發性腦功能障礙性疾病。WHO已將其列為世界范圍內最容易影響日常生活和工作的疾病之一^［1］，以及最容易致殘的疾病之一，其致殘性與四肢癱瘓相等同^［2］。盡管偏頭痛的發病率很高（我國患病率為0.99%，發達國家平均為12%），但其真正的病理生理學機制至今仍不清楚，對于其治療亦存在諸多不足，即便是急性發作的特異性治療，亦難獲滿意療效。故對偏頭痛的確切發病機制及治療研究有待進一步深入進行。

細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是目前疼痛研究進展中備受關注的信號轉導通路。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK) 家族中的一員。在初級傳入傷害感受神經元周圍末梢中存在絲裂原活化蛋白（MAP)激酶ERK的磷酸化形式（p-ERK）是這些傷害感受神經元興奮的重要解剖學標志^［3，4］。

肥大細胞脫顆粒能引起與其相鄰的三叉神經腦膜傷害感受器持續激活，而這種激活是與p-ERK表達增加相伴隨的^［5］。本實驗通過建立硝酸甘油（GTN）誘導的大鼠偏頭痛模型，檢測p-ERK的表達情況及p-ERK與肥大細胞脫顆粒間的關系，以探討p-ERK在偏頭痛發病過程中的病理生理作用，為偏頭痛的治療提供新的實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組24只健康雄性SD（250 g～300 g）大鼠，隨機分為模型組（n=18）和空白對照組（n=6）。模型組采用皮下注射GTN（10 mg/kg）法建立大鼠偏頭痛模型，再將模型組隨機分為3亞組，每組6只，C48/80組（腹腔注射肥大細胞脫顆粒劑Compound48/80，2 mg/kg）；SCG+ C48/80組（SCG，10 mg/kg后再注射C48/80，2 mg/kg）和實驗對照組（腹腔注射生理鹽水 2 mg/kg ），模型組各亞組分別注射C48/80、SCG+C48/80、生理鹽水，15 min后取硬腦膜和三叉神經核尾部標本。空白對照組大鼠皮下注射等量生理鹽水，15 min后取標本。

1.2偏頭痛模型制備采用皮下注射GTN制作偏頭痛模型^［6］，大鼠按10 mg/kg頸部皮下注射GTN（廣州白云山明興制藥有限公司 批號:20090505）。5 min ～15 min大鼠出現雙耳發紅、后肢頻繁撓頭、爬籠次數增多等煩躁不安的現象，40 min～60 min達高峰。此現象可持續1 h～3 h，繼之大鼠呈現蜷臥、活動減少狀態。空白對照組大鼠皮下注射等劑量生理鹽水。

1.3免疫組織化學將大鼠置于江灣Ⅰ型C立體定向儀上，取硬腦膜后取腦干(A系統定位于A 0.3 mm～5.7 mm，即耳間線后方0.3 mm～5.7 mm) ^［7］，將所取硬腦膜和組織塊立即置于4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS固定4 h后，移入含30%的0.1 mol/L PBS液中過夜沉底（4 ℃）。連續冰凍切片，厚度為5 μm。DAB顯色、酸性甲苯胺藍復染、脫水、透明，中性樹膠封片。陰性對照染色切片中用PBS代替一抗，其余步驟相同，結果均為陰性。

1.4圖像分析采用MIAS-2000圖像分析系統，目標平均灰度級（G0)、視場平均灰度級(Gv )和目標面積與視場面積比(AAR)，測試儀器的最大灰度分級(G_max)為255，應用免疫組織化學定量計算公式計算陽性單位(positive unit，PU):

PU=|G₀-G_v|(1-A_AR)×G_max×100

1.5統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件分析。正態分布數據以均數±標準差(x±s)表示，多組數據比較用完全隨機設計資料的方差分析、LSD-t檢驗。

2結果

2.1免疫組織化學染色在模型組各亞組和空白對照組的硬腦膜和三叉神經核尾部均可見p-ERK的陽性免疫反應產物，前者陽性免疫產物染色較深且主要分布于脫顆粒的肥大細胞附近，后者陽性細胞染色較淡。即模型組各亞組大鼠硬腦膜、三叉神經尾核均有p-ERK的陽性免疫反應產物增強，鏡下觀察以C48/80組最為顯著。

2.2PU值檢測結果ERK在模型組各亞組和空白對照組的硬腦膜和三叉神經核尾部都發生了磷酸化，但模型組各亞組p-ERK陽性免疫反應產物都明顯高于空白對照組（P<0.05），且C48/80組高于SCG+C48/80組和實驗對照組（P<0.05）。詳見表1。3討論

近年來大量研究表明，體內多種生理、病理性刺激，如：神經生長因子、激素、炎性細胞因子、缺血損傷、神經損傷、電驚厥休克、高滲、紫外線照射等［8-15］，均可引起腦內p-ERK的迅速增強，甚至在刺激后數分鐘內即可觀察到［13-15］。而其對不同刺激可產生增強和抑制雙向變化，成為國內外研究神經元發生功能活動的標志之一。

在偏頭痛發病機制的諸多學說中，三叉神經血管炎癥學說近年來備受矚目。受神經支配的硬腦膜痛覺纖維興奮在偏頭痛顱內疼痛中起重要作用［16-18］。肥大細胞遍布于人類^［19］和嚙齒類［20-22］動物的硬腦膜和腦內，圍繞血管周圍分布，與初級傷害感受神經元有較近的并置關系。在初級傳入感受傷害神經元中傷害性刺激能引起一系列生化變化，研究表明，在初級傳入感受傷害神經元周圍末梢中存在MAP激酶ERK的磷酸化形式（p-ERK），是這些感受傷害神經元興奮的重要解剖學標志^［3，4］。肥大細胞脫顆粒能引起與其相鄰的三叉神經腦膜傷害感受器持續激活，而這種激活是與p-ERK表達增加相伴隨的^［5］。Obata等^［23］證明在產生痛覺敏化的過程中脊髓背角ERK的激活起了關鍵作用。Ji等^［14］研究發現，ERK 在脊髓背角神經元中的激活是傷害特異性的。

本實驗結果顯示，在空白對照組大鼠硬腦膜和三叉神經核尾部內也出現少量p-ERK的表達，其原因是在未受刺激的正常動物腦內就有ERK磷酸化的現象。偏頭痛模型組各亞組內均有p-ERK的表達，且明顯高于空白對照組（P<0.05），證明偏頭痛時的確有p-ERK表達的增加，而模型組中的C48/80亞組p-ERK的表達明顯高于實驗對照組和SCG+C48/80組（P<0.05），這是由于對模型組各亞組采取了促進或抑制肥大細胞脫顆粒的處理。C48/80組給予肥大細胞脫顆粒劑后肥大細胞脫顆粒的數量明顯增多，隨著肥大細胞脫顆粒數目的增多，p-ERK的表達也顯著增加；SCG+C48/80組p-ERK的表達較C48/80組少，但仍高于實驗對照組的基線水平，其原因是雖然在注射肥大細胞脫顆粒劑前先給予了肥大細胞穩定劑，但由于肥大細胞穩定劑色甘酸鈉并不能完全抑制肥大細胞內的異染顆粒，p-ERK表達減少，偏頭痛的發生過程可能確實有ERK磷酸化的參與，而肥大細胞脫顆粒是導致p-ERK表達增加的重要原因。ERK作為信號通路多個上游區調節器的最后共同效應器，一旦被激活既可以產生短期的功能性（非轉錄水平）的改變，也可以通過轉錄和翻譯引起長期的適應性改變，故只要阻止了ERK的激活，就有可能阻止細胞外信號向細胞內的傳導，這可能為開發有效的治療偏頭痛藥物提供了新的實驗依據。

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作者簡介：趙麗娟，女，現為山西醫科大學第一醫院神經內科在讀碩士研究生（郵編：030001）；牛爭平（通訊作者），工作于山西醫科大學第一醫院（郵編：030001）。

（收稿日期：2011-01-18）

（本文編輯王雅潔）