富含血小板血漿雙相接種法構建組織工程骨

[摘要]目的：傳統的細胞接種法接種效率低，影響組織工程骨的成骨質量。本研究預探討富含血小板血漿雙相接種法是否可以提高細胞接種效率、優化組織工程骨的構建。方法：分別用富含血小板血漿、乏血小板血漿重懸BMSCs，灌注于三維多孔PLGA支架中，凝血酶促凝，體外培養。通過掃描電鏡觀察支架表面的細胞分布；通過檢測支架內DNA含量、ALP含量、成骨基因表達情況分析細胞的接種效率、增殖和分化情況，并與傳統的接種方法進行比較。結果：富含血小板血漿和乏血小板血漿雙相接種法均能提高細胞與三維支架的結合效率；富含血小板血漿還可以促進支架內細胞的增殖，同時不影響細胞的分化。結論：雙相接種法可以提高細胞的接種效率；與普通雙相接種法相比，富含血小板血漿雙相接種法可以進一步優化組織工程骨的構建。

[關鍵詞]富含血小板血漿；細胞接種；骨組織工程

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0402-06

Constructing tissue engineering bone by a biphasic seeding strategy with platelet-rich plasma

LEI Hua，XIAO Ran，CAO Rui，LV Xiao-yan，GUI Lai

(The Sixth Department，Plastic Surgery Hospital，Peking Union Medical College， China Academy of Medical Sciences，Peking，Beijing 100144，China)

Abstract:ObjectiveThe conventional static seeding is not efficient in constructing tissue engineering bone， which impacts the quality of osteogenesis. This study wants to prove if a biphasic seeding strategy with platelet-rich plasma (PRP) can improve the conventional static seeding.MethodsThe BMSCs suspension in PRP or platelet-poor plasma （PPP） was infiltrated in 3D PLGA scaffolds， clotted by thrombin and cultured for different days. The cell seeding efficiency was evaluated by SEM and by measuring initial DNA contents in 3D scaffolds. The cell proliferation was evaluated by measuring DNA contents in 3D scaffolds in different culture days.The cell differentiation was evaluated by measuring ALP contents and osteogenesis gene expression in 3D scaffolds.Results PRP and PPP could improve the integration of cells and 3D scaffolds. PRP also could enhance the cell proliferation and did not impact the cell differentiation in 3D scaffolds.ConclusionThe biphasic seeding strategy can improve the cell seeding efficiency. PRP can optimize the constructing of tissue engineering bone.

Key words: platelet-rich plasma (PRP);cell seeding;bone tissue engineering

骨組織工程學中，細胞與三位支架的結合即細胞接種是非常重要的一步，目前常用的細胞接種方法仍是靜置接種法，即細胞懸液直接滴加在支架表面。此方法適用于各種細胞和支架，但效率低，不僅細胞流失多，細胞也不易均勻布于支架內部[1-2]。因此，有很多研究探討如何將細胞高效且均勻地分布于支架內。其中有學者將細胞重懸于纖維蛋白原[3-6]或膠原[7-13]的溶液中，將此溶液灌注于支架中，再用促凝劑使溶液凝成凝膠，固定細胞于支架內--即雙相接種法。研究表明此方法不僅使細胞與支架的結合效率提高，而且細胞可以灌注于支架內部，有利于細胞的均勻分布。

本研究試用富含血小板血漿（platelet-rich plasma， PRP）替代纖維蛋白原和膠原作為雙相接種媒介改進細胞接種方法。因為PRP（內含豐富自體纖維蛋白原）不僅具有與纖維蛋白原一樣的雙相性，更重要的是它含有大量血小板，血小板在促凝劑激活時釋放大量活性蛋白，其中包括多種生長因子。所以理論上用PRP接種細胞時可以向支架中輸送生長因子和其他活性蛋白，這樣不僅可以機械性地將細胞固定于支架中，還可以進一步促進細胞的粘附、增殖、分化等生物事件。為證實我們的設想，本實驗用傳統靜置接種法、乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）和PRP雙相接種法構建細胞支架復合物，比較三種方法的接種效率，觀察細胞在支架內的增殖和分化情況。

1材料和方法

1.1 山羊骨髓抽取：中國青山羊一只，5月，10kg。速眠新（長春軍事醫學科學院）1.5ml肌肉注射麻醉。18號骨髓穿刺針于髂后上嵴抽取5ml骨髓。

1.2BMSCs原代培養及傳代：人淋巴細胞分離液（Boster，武漢）密度梯度離心分層骨髓，取中層有核細胞層至25cm2培養瓶中（Corning， Germany），加入基礎培養基4ml，主要成分高糖DMEM（Hyclone，USA），10% FBS（Hyclone，USA），100U/ml 青霉素（Sigma，China），100mg/ml鏈霉素（Sigma，China）。37℃，5% CO2，孵育4天首次換液，隨后3天換一次液。待細胞90%融合，0.25%胰酶消化細胞、收集、重懸，以5 000/cm2的密度接種于75cm2培養瓶中傳代，每3天換液一次。第三代細胞用于以下實驗。

1.3 BMSCs成骨誘導培養及鑒定：誘導培養基的成分為：DMEM（Hyclone，USA），10% FBS（Hyclone， USA），100U/ml 青霉素（Sigma，China），100mg/ml 鏈霉素（Sigma，China），0.1μM 地塞米松（Sigma，USA）， 10mM β-磷酸甘油酯（Sigma，USA） and 0.17mM 維生素C（Sigma，USA）。將第三代細胞以1 000/cm2的密度接種于35mm的培養皿中（Corning， Germany），加入基礎培養基孵育24h，換液，加入誘導培養基向成骨細胞誘導培養。每3天換液一次。

誘導7天后，用CAKP試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）進行ALP染色。成骨細胞胞質中可見紅或棕色ALP陽性顆粒。誘導14天后，用茜素紅（中國阿拉丁試劑有限公司）進行鈣結節染色。鈣化結節呈現不同的紅色。

1.4 PRP和PPP的制備：中國青山羊一只，5月，10kg。速眠新1.5ml肌肉注射麻醉。50ml注射器內含5mlACD（0.48g檸檬酸，1.32g檸檬酸鈉，1.47g葡萄糖溶于100ml雙蒸水），于頸靜脈抽取全血40ml，離心1 000g，15min，取上層血漿二次離心，3 000g，20min。上層為清亮的PPP，移入另一5ml離心管中備用。中間層為白色的血小板團輕用吸管吸出移至另一離心管中。用少量PPP將血小板團重懸，人工血小板計數，調節成濃度為106/μl 的PRP備用[14-16]。PPP中血小板濃度104/μl。

1.5 PLGA支架預處理：PLGA支架由濟南岱罡生物科技有限公司提供。PLA:PGA=75:25。孔徑大小100～300μm，空隙率80%。將大塊PLGA切成5mm×5mm×3mm小立方體，供體外研究使用。PLGA立方體浸泡于75%酒精中消毒24h，PBS漂洗3次，DMEM孵育30min，取出至于無菌紗布上，吸干大部分水分。

1.6 三種接種方法構建細胞/支架復合體：方法一，為傳統靜置接種法，即DMEM重懸細胞，調節細胞密度至5×106/ml。滴加80μl細胞懸液/支架，37℃，5% CO2，孵育2h，移入六孔板，每孔5ml誘導培養基。方法二，PPP重懸細胞，調節細胞密度至5×106/ml。滴加80μl細胞懸液/支架，隨即滴加30μl凝血酶溶液（10 000IU凝血酶（Sigma，USA）加入10%CaCl2（Sigma，China）中），加蓋，37℃，5% CO2，孵育30min，移入六孔板，每孔5ml誘導培養基。方法三，PRP重懸細胞，其余同方法二。每3天換一次液。接種后24h 倒置顯微鏡下觀察。

1.7 細胞/支架復合體電鏡掃描：細胞/支架復合體培養3天、7天后，2.5%戊二醛固定，30%～100%的梯度乙醇脫水，真空干燥，表面噴金處理后在掃描電鏡下觀察照相。

1.8 細胞/支架復合體DNA定量分析：分別于1天、5天、9天、14天每組取4個細胞/支架復合體，PBS漂洗兩次，放入7ml離心管中，剪成小塊，加1ml骨細胞消化液[11，13]，37℃水浴2h。將消化混合液吸入另一個7ml離心管，超聲細胞破碎機處理5次，6s/次，共30s，離心200g，5min，取上清液待用。

上清液40μl置于96孔黑色不透光酶標板內，每個樣本兩個副孔，每孔加160μl Hoechst 33258（Sigma，USA）測試液（1μg/ml），放入熒光酶標儀樣品槽，震蕩混勻30s，選擇激發波長360nm，發射波長460nm，測定樣品的熒光強度。以小牛胸腺DNA（Sigma USA）做標準曲線。實驗重復3次。

1.9 細胞/支架復合體ALP活性定量分析：取方法8中的上清液，用堿性磷酸酶試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）測定ALP活性。50μl上清液加500μl緩沖液、500μl基質液，充分混合，37℃水浴3h。分光光度計520nm測定吸光度。吸光度的OD值代表復合體的ALP活性。實驗重復3次。

1.10 細胞/支架復合體成骨基因相對定量分析：每個復合體置入2ml Eppendorf 管中，加入1mlTrizol（Invitrogen，USA），剪碎復合體， 4℃放置1h，待復合體完全溶解于Trizol，提取總RNA。根據反轉錄試劑盒(ABI，USA)提供的實驗步驟，反轉錄合成cDNA。各引物均由北京基萊生物科技有限公司合成。實時定量PCR反應體系為25μl，ABI7900HT定量PCR儀(ABI，USA)的反應程序：50℃ 2min→95℃ 10min →(95℃ 15s → 60℃ 1min)×40個循環→95℃ 15s→ 60℃ 1min→95℃ 15s---20℃終止反應。管家基因GAPDH作為內對照，每個樣本設置3個復孔。管家基因和目的基因的引物核苷酸序列，產物大小，退火溫度總結于表1。 對于每一個樣本CT 值是PCR產物達到可探測的熒光強度時復制循環次數。用2-△△CT方法計算每個目的基因每個時間點的現對表達水平。對于每一個目的基因，△△CT=(CT，目的基因-CT，管家基因)Time x-標準△CT，標準△CT為DMEM組(CT，目的基因t-CT，管家基因)Time 0[17]。

1.11 每個數值以平均值±標準差表示，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey's test。設P<0.05具有統計學顯著差異性。表1。

2結果

2.1 BMSCs成骨誘導培養：BMSCs誘導培養7天后，ALP染色為陽性，誘導14天后，茜素紅染色為陽性。說明本實驗條件下，自山羊骨髓中可分離培養出骨髓基質細胞，經誘導后，可向成骨細胞分化(圖1)。

2.2 三種接種方法接種效率比較：細胞接種后24h，光學顯微鏡下觀察，DMEM組的六孔板底以復合體為中心布滿貼壁的BMSCs，PRP組六孔板底以復合體為中心布滿血小板，PPP組六孔板底清潔，偶見單個細胞（圖2）。

掃描電鏡觀察顯示，DMEM組支架表面粘附的細胞明顯較PPP和PRP組少，PPP和PRP組支架表面不僅粘附大量細胞還有膠原纖維附著。7天時，PPP和PRP組支架表面的細胞呈現伸展平鋪狀態（圖3A、B）。

細胞接種后24h，細胞/支架復合體內DNA檢測顯示，DMEM組的DNA含量顯著低于PPP和PRP組（P<0.05），而PPP和PRP組的DNA含量無差別（圖4）。

2.3 BMSCs/PLGA復合體內BMSCs增殖比較：復合體中DNA的含量代表BMSCs的數量，DNA的增加表示BMSCs的增殖，數據如圖4所示。在DMEM組中，從接種后1～9天，BMSCs快速增殖（P<0.05），但從9～14天，BMSCs增殖進入平臺期（P>0.05）。PRP組中的BMSCs顯示了同樣的趨勢。但PRP組中的BMSCs自接種后1～14天，一直顯著增殖（P<0.05）。5天，9天，14天PRP組的BMSCs顯著高于其他兩組（P<0.05），9天和14天時，PPP組BMSCs數量顯著高于DMEM組（P<0.05）。

2.4 BMSCs/PLGA復合體ALP活性比較：DMED組和PPP組復合體的ALP活性自1～9天平穩上升，9天時的ALP活性顯著高于1天（P<0.05），但自9天開始緩慢下降，14天時的ALP活性仍然顯著高于1天（P<0.05）。PRP組ALP活性自1～5天平穩上升（P>0.05），5～9天快速上升（P<0.05），自9天開始平穩下降，但至14天，ALP活性仍顯著高于1天，5天（P<0.05）。9天，14天時PRP組ALP活性顯著高于其他兩組（P<0.05）；PPP組在5天，9天時高于DMEM組，但并不顯著（P>0.05），14天時兩組達同一水平。數據如圖5所示。

2.5. MSCs/PLGA復合體成骨基因相對定量比較：如圖6。①圖6A：1天和5天，3組的ALP表達無顯著差異（P>0.05），9天時PRP組顯著高于其他兩組（P<0.05），14天時，PRP組顯著高于DMEM組（P<0.05），略高于PPP組（P>0.05）；②圖6B：1天，5天，9天 DMEM組的CollagenⅠ基因表達高于其他兩組，但只有5天時有顯著差異（P<0.05），隨著DMEM組下調，PPP和PRP組上調，14天時DMEM組表達最低，PRP組表達最高，但彼此之間的差異不顯著（P>0.05）；③圖6C：1天時，PPP組顯著高于其他兩組（P<0.05），5天時PPP組顯著高于DMEM組（P<0.05），略高于PRP組（P>0.05）。9天時，3組之間無顯著差異。14天時，PRP組顯著高于其他兩組（P<0.05）。

總的趨勢是，PRP組的成骨性基因表達在培養早期明顯低于其他兩組，但隨著培養時間延長，PRP組的基因表達逐漸上調，14天時都達到最高水平。

3討論

骨組織工程研究中，三維多孔支架已經廣泛用于構建組織工程骨[18-19]。但是，細胞與支架的復合效率卻不令人滿意[2，20-27]，而且有研究顯示，體內的成骨只發生在支架的周邊，在多孔支架的中心無骨組織形成[20，28-29]。這可能是由于在細胞接種時，細胞不能進入支架的內部[20]，而且隨著細胞的粘附和擴增進一步阻礙了細胞向支架內部移動[26]。可見，細胞接種是構建細胞/支架復合體的關鍵，直接影響骨再生的質量。因此，很多學者研究了有利于細胞均勻分布于三維多孔支架內的接種方法，例如低壓接種系統[20]，生物反應器灌注系統[2，21]，旋轉燒瓶接種法[7]，離心接種法[25，27]，及表面聲波技術[26]。這些接種技術均表現出良好效果，但是有些需要特殊設備不利于普及推廣，有些步驟繁瑣、耗時長增加了污染的機會。與這些技術相比，由纖維蛋白原和膠原介導的雙相接種法簡單、經濟、方便、適用于各種細胞和支架。它也屬于靜置接種法，但是與傳統靜置接種法不同的是，通過纖維蛋白原和膠原的變相功能可以把細胞固定在支架中，而且有研究表明此方法可以使細胞均勻分布支架中[3，7-13]。

另一方面，隨著三維支架孔徑增大孔隙率提高，支架表面積與體積的比值必然下降，所以致使只有與孔壁接觸的細胞能夠粘附于孔壁表面，而那些懸在孔中的細胞則會被培養基沖洗掉或沉淀至支架底部[7]。纖維蛋白原和膠原作為細胞接種媒介可以通過凝成凝膠將懸在孔中的細胞包埋固定在支架內，從而提高細胞接種效率[3，7-10]。但是，其他接種方法沒有這個功能，因此，我們認為由纖維蛋白原和膠原介導的雙相接種法是值得推廣和進一步研究的。

本研究用PRP代替纖維蛋白原和膠原作為雙相接種媒介輸送細胞至支架內，目的在于進一步改進雙相接種法。

結果顯示，PRP和PPP (自體纖維蛋白原) 都可以將BMSCs 全部復合在支架中，幾乎沒有細胞散落；掃描電鏡也顯示PRP和PPP組復合體表面粘附大量細胞；在細胞接種后24h，PPP和PRP組復合體的DNA量顯著高于DMEM組。這些都說明PRP與PPP一樣可以通過凝膠作用顯著提高細胞接種效率。但是，隨著培養時間延長，PRP組BMSCs 的增殖速率顯著較PPP組快，這表明PRP較PPP更能促進BMSCs的增殖。在以往的研究中，只有高濃度的PRP(2.5×108血小板/細胞支架復合體)才能有效促進細胞增殖，低濃度的PRP(0.625×108 and 0.16×108血小板/細胞支架復合體)沒有明顯效應[30]。但是，我們的研究中，PRP的濃度是0.8×108血小板/細胞支架復合體，仍然顯示明顯的促BMSCs增殖作用。這可能是因為血小板和細胞一樣充填并被固定在孔隙中，當血小板被凝血酶激活后，釋放生長因子等大量活性蛋白，通過類似旁分泌的作用方式作用于周邊的BMSCs，所以，盡管PRP的濃度不高，但作用很強。而以往的研究，只是將PRP凝集在細胞支架復合物的表面，血小板釋放的活性蛋白不容易滲入支架內部發揮作用，所以只有通過提高PRP濃度才能表現出明顯的生物學效應[30]。

有實驗顯示經高濃度PRP做用的BMSCs，其ALP活性下降，因此認為PRP抑制BMSCs的成骨分化[30-31]。本實驗結果顯示，在培養早期（5天內），PRP組ALP活性與其他兩組無明顯差異，可這個時期PRP組的BMSCs數量卻明顯較其他兩組多，這似乎表明BMSCs的成骨分化被抑制。但是隨著培養時間延長，PRP組ALP活性迅速上升，到9天、14天已經顯著高于其他兩組。因此，我們認為并不是PRP抑制了BMSCs的成骨分化，而是由于PRP的促細胞增殖作用使PRP組中的BMSCs在培養早期大多數處于有絲分裂狀態或剛剛完成分裂，也就是處于未分化狀態，當BMSCs完成增殖，開始發育成熟轉變為成骨細胞，ALP活性也隨之增加。Arpornmaeklong等的研究也表明經高濃度的PRP作用的細胞支架復合體，細胞ALP活性在15天后開始增高[30]。

為了進一步明確PRP對BMSCs成骨分化的影響，我們對細胞支架復合體中成骨性基因ALP、 CollagenⅠ、Osteonectin的表達進行相對定量分析。結果顯示，在細胞支架復合體培養早期，PRP組3個成骨基因的表達較其他兩組低，但是隨著培養時間延長，表達迅速上調， ALP在9天時達各組最高水平， CollagenⅠ和Osteonectin 14天時達到3各組最高水平。此結果與ALP活性分析結果相符，這說明PRP并不是抑制了BMSCs的成骨性分化，而是因為培養早期，BMSCs處于增殖狀態，當其完成增殖時必然會向成骨方向分化，也就是說，PRP不是抑制了BMSCs的分化，而是由于促進細胞增殖的原因而使分化推遲了。

PRP已經被廣泛應用于臨床及實驗研究，除了與BMSCs或自體松質骨顆粒混合可以促進骨組織再生外[14，32-34]，它還可以用于像面頸部除皺、乳房縮小或增大等美容整形手術，以減少術后血腫、血清腫、瘀斑、腫脹[36-37]。PRP還被用于置入牙種植體或人工骨移植物周圍以提高和加速骨整合[16，38]。但據我們查閱的大量文獻，至今沒有研究將PRP用于細胞接種，我們首次提出PRP雙相接種法，經實驗檢測，效果良好。

從本實驗方法可以看出，PRP雙相接種法是一個很實用的接種方法。PRP可以由自體全血經兩步離心獲得，無毒、無免疫源性，因此說此方法既安全又經濟。如果與其他方法結合，如低壓接種法、離心接種法，可能會更有效地輸送細胞至三維多孔支架內。此方法也適用于其他細胞系的接種，用于其他組織的組織工程學研究，如脂肪、軟骨。

4結論

本研究結果顯示：以富含血小板血漿(PRP) 為媒介的雙相接種法，不僅可以大大提高BMSCs接種于三維多孔PLGA支架的效率，還可以促進BMSCs在支架中的增殖，同時不抑制其成骨性分化。這些結果說明PRP雙相接種法在組織工程骨構建中具有實際應用價值，為組織工程骨的臨床應用奠定一定基礎。

[參考文獻]

[1]Li Y，Ma T，Kniss DA，et al. Effects of filtration seeding on cell density， spatial distribution， and proliferation in nonwoven fibrous matrices[J]. Biotechnol Prog， 2001，17(5):935-944.

[2]Wendt D，Marsano A，Jakob M，et al. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity[J]. Biotechnol Bioeng，2003，84(2):205-214.

[3]Karp JM， Sarraf F， Shoichet MS， et al. Fibrin-filled scaffolds for bone-tissue engineering: An in vivo study[J]. J Biomed Mater Res A，2004，71(1):162-171.

[4]Chim H，Schantz JT. Human circulating peripheral blood mononuclear cells for calvarial bone tissue engineering[J]. Plast Reconstr Surg，2006，117(2):468-478.

[5]Zheng YX， Ringe J，Liang Z，et al. Osteogenic potential of human periosteum-derived progenitor cells in PLGA scaffold using allogeneic serum[J]. J Zhejiang Univ SCIENCE B，2006，7(10):817-824.

[6]Jaquie?ry C，Schaeren S，Farhadi J，et al. In vitro osteogenic differentiation and in vivo bone-forming capacity of human isogenic jaw periosteal cells and bone marrow stromal cells[J].Ann Surg，2005，242(6):859-868.

[7]Toh YC，Ho ST，Zhou Y，et al. Application of a polyelectrolyte complex coacervation method to improve seeding efficiency of bone marrow stromal cells in a 3D culture system[J].Biomaterials，2005，26(19):4149-4160.

[8]Ushida T， Furukawa K， Toita K， et al. Three-dimensional seeding of chondrocytes encapsulated in collagen gel into PLLA scaffolds[J].Cell Transplant， 2002，11(5):489-494.

[9]Taira M，Araki Y.Scaffold consisting of poly (lactide-caprolactone) sponge， collagen gel and bone marrow stromal cells for tissue engineering[J].J Mater Sci Lett，2001，10(2):1773-1774.

[10]Sittinger M，Hutmacher DW，Risbud MV.Current strategies for cell delivery in cartilage and bone regeneration[J].Curr Opin Biotechnol，2004，15(5):411-418.

[11]呂仁發，周強，許建中，等.雙相接種法體外構建組織工程骨[J].第三軍醫大學學報，2005，27(16):1656-1659.

[12]秦輝，許建中，王序全，等.雙相接種技術構建組織工程骨的異位成骨觀察[J].第三軍醫大學學報，2005，27(16):1660-1662.

[13]呂仁發，周強，許建中，等.種子細胞雙相接種技術促進組織工程骨體外成熟的研究[J].中華創傷雜志，2006，22(4）：291-295.

[14]Yamada Y，Ueda M，Naiki T，et al. Autogenous injectable bone for regeneration with mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: tissue-engineered bone regeneration[J].Tissue Eng，2004，10(5-6):955-964.

[15]Sarkar MR，Augat P，Shefelbine SJ，et al. Bone formation in a long bone defect model using a platelet-rich plasma-loaded collagen scaffold[J].Biomaterials， 2006，27(9):1817-1823.

[16]Weibrich G，Hansen T，Kleis W，et al. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration[J].Bone，2004，34(4):665-671.

[17]Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J].Methods， 2001，25(4):402-408.

[18]Muschler GF，Nakamoto C，Griffith LG.Engineering principles of clinical cell-based tissue engineering[J]. J Bone Joint Surg Am，2004，86-A(7):1541-1558.

[19]Trojani C，Weiss P，Michiels JF，et al. Three-dimensional culture and differentiation of human osteogenic cells in an injectable hydroxypropylmethylcellulose hydrogel[J].Biomaterials，2005，26(27):5509-5517.

[20]Wang J，Asou Y，Sekiya I，et al. Enhancement of tissue engineered bone formation by a low pressure system improving cell seeding and medium perfusion into a porous scaffold[J].Biomaterials，2006，27(13):2738-2746.

[21]Glowacki J，Mizuno S，Greenberger JS. Perfusion enhances functions of bone marrow stromal cells in three-dimensional culture[J].Cell Transplant，1998，7(3):319-326.

[22]Schneider GB，English A，Abraham M，et al. The effect of hydrogel charge density on cell attachment[J].Biomaterials，2004，25(15):3023-3028.

[23]Burg KJ，Holder WD Jr，Culberson CR，et al. Comparative study of seeding methods for three-dimensional polymeric scaffolds[J].J Biomed Mater Res，2000，51(4):642-649.

[24]Atthoff B，Aulin C，Adel?w C，et al. Polarized protein membrane for high cell seeding efficiency[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，83(2):472-480.

[25]Roh JD，Nelson GN，Udelsman BV，et al. Centrifugal seeding increases seeding efficiency and cellular distribution of bone marrow stromal cells in porous biodegradable scaffolds[J].Tissue Eng，2007，13(11):2743-2749.

[26]Li H， Friend JR，Yeo LY.A scaffold cell seeding method driven by surface acoustic waves[J].Biomaterials，2007，28(28):4098-4104.

[27]Godbey WT，Hindy SB， Sherman ME， et al. A novel use of centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds[J]. Biomaterials，2004，25(14):2799-2805.

[28]Dong J，Uemura T，Shirasaki Y，et al. Promotion of bone formation using highly pure porous b-TCP combined with bone marrow-derived osteoprogenitor cells[J]. Biomaterials，2002，23(23):4493-4502.

[29]Yoshikawa T，Ohgushi H，Tamai S.Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxapatite[J].J Biomed Mater Res，1996，32(3):481-492.

[30] Arpornmaeklong P， Kochel M， Depprich R， et al. Influence of platelet-rich plasma (PRP) on osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells. An in vitro study[J].Int J Oral Maxillofac Surg，2004，33(1):60-70.

[31]Ogino Y，Ayukawa Y，Tsukiyama Y，et al. The effect of platelet-rich plasma on the cellular response of rat bone marrow cells in vitro[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2005，100(3):302-307.

[32]Dallari D，Fini M，Stagni C，et al. In vivo study on the healing of bone defects treated with bone marrow stromal cells， platelet-rich plasma， and freeze-dried bone allografts，alone and in combination[J].J Orthop Res， 2006，24(5):877-888.

[33]Ohya M，Yamada Y，Ozawa R，et al. Sinus floor elevation applied tissue-engineered bone[J]. Comparative study between mesenchymal stem cells/platelet-rich plasma (PRP) and autogenous bone with PRP complexes in rabbits[J].Clin Oral Implants Res，2005，16(5):622-629.

[34]Graziani F，Ducci F，Tonelli M，et al. Maxillary sinus augmentation with platelet-rich plasma and fibrinogen cryoprecipitate: a tomographic pilot study[J]. Implant Dent，2005，14(1):63-69.

[35]Kassolis JD， Reynolds MA. Evaluation of the adjunctive benefits of platelet-rich plasma in subantral sinus augmentation[J].J Craniofac Surg，2005，16(2):280-287.

[36]Man D，Plosker H，Winland-Brown JE. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery[J]. Plast Reconstr Surg，2001，107(1):229-237.

[37]Marchac D，Greensmith AL. Early postoperative efficacy of fibrin glue in face lifts: a prospective randomized trial[J]. Plast Reconstr Surg， 2005，115(3):911-916.

[38]Yamada Y，Ueda M，Hibi H，et al.Translational research for injectable tissue-engineered bone regeneration using mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: from basic research to clinical case study[J].Cell Transplant， 2004，13(4):343-355.

[收稿日期]2010-11-23 [修回日期]2011-01-19

編輯/張惠娟