自體基質血管成分改善脂肪組織移植效果的實驗研究

[摘要]目的：分析自體脂肪基質血管成分（stromal vascular fraction cells，SVF）對脂肪顆粒（adipose granule，AG）移植的作用。方法：從6只健康新西蘭家兔背部肩胛區獲取脂肪組織，實驗組將自體SVF與自體AG復合，植入家兔耳部皮下，對照為單純脂肪移植。在術后1、3、6個月，用B超和游標卡尺測量移植脂肪體積；術后6個月取材常規組織學觀察。結果：術后1、3、6個月對照組脂肪組織存活率分別為：（64.35±8.36）%、（58.22±2.88）%、（50.61±9.47）%；實驗組脂肪組織存活率分別為：（77.42±5.1）%、（67.95±6.09）%、（72.75±4.37）%。兩組比較均存在顯著性差異（P<0.05）。術后6個月組織學觀察兩組呈正常脂肪組織形態，未見明顯差異。結論：自體SVF復合脂肪顆粒能夠顯著提高移植脂肪組織的成活率，為臨床脂肪移植提供實驗依據。

[關鍵詞]脂肪組織；移植；脂肪干細胞；基質血管成分

[中圖分類號]R617[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0425-03

Experimental study on stromal vascular fraction (SVF) cells to improve the effect of autologous fat tissue transplantation

TAN Xin-ying1， ZHANG Hai-xia2， LIU Bin3， LIU Yan-pu1， XU Xiao-fang1， LI Long1， LINGHU Da-ke1， XU Hai-yan4

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery， School of Stomatology， The Fourth Military Medical University， Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Department of Stomatology， 451 Hospital of PLA， Xi'an 710054，Shaanxi，China; 3.Department of Oral Biology and Laboratory Animal Center， School of Stomatology， The Fourth Military Medical University;4. Laboratory Animal Center， School of Stomatology， The Fourth Military Medical University)

Abstract:Objective The present study evaluated the role of stromal vascular fraction (SVF) cells on autologous adipose granule (AG) transplantation. Methods Adipose tissue was harvested in the scapular region of 6 healthy New Zealand white rabbits. Stromal vascular fraction (SVF) cells combined with autologous adipose granule were implanted in the ears of the rabbits as the experiment group. Pure adipose granule was as the control group. The volume of adipose tissue was evaluated 1， 3 and 6 months after surgery by B-mode ultrasound and caliper. Both ears of the rabbits were compared histologically 6 months after surgery.Results1、3、6 months after surgery， the survival rates of the control group were（64.35±8.36）%、（58.22±2.88）%、（50.61±9.47）%；the survival rates of the experiment group were （77.42±5.1）%、（67.95±6.09）%、（72.75±4.37）%.The differences of the two groups were statistical significant (P<0.05). 6 months after surgery， HE staining of both groups was similar to normal adipose tissue and there was no significant difference between the two groups. Conclusion Autologous stromal vascular fraction (SVF) cells can improve the survival rate of transplanted fat tissue and provide experimental basis for clinical fat transplantation.

Key words: adipose tissue; transplantation；ADSCs; stromal vascular fraction

由于先天性畸形、外傷、腫瘤切除、顏面部衰老等原因所導致的口腔頜面部軟組織缺損修復是口腔頜面外科和整形外科醫生面臨的重大難題。目前最主要的修復方法之一是自體脂肪組織抽吸注射移植。然而不可預知的吸收率（20%～90%）往往需要過度充填或重復注射2～3次才能達到滿意的效果[1-2]。這主要是因為脂肪組織移植后，血液循環系統尚未建立，移植的脂肪細胞對缺血缺氧非常敏感，而且成熟的脂肪細胞不易再生，脂肪組織移植物很容易發生變性壞死，從而吸收、縮小[3]。本研究觀察自體基質血管成分（stromal va scular fraction cells，SVF）對移植脂肪顆粒(adipose granule，AG)成活的作用，為臨床應用提供實驗依據。

1材料和方法

1.1主要試劑：DMED低糖培養基（美國GIBCO公司）；戊巴比妥鈉（科昊生物工程有限責任公司，生產批號：DH0602），用蒸餾水配置成3%的工作液；Ⅰ型膠原酶（美國GIBCO公司），用DMEM低糖培養基配置成0.25%的工作液。

1.2 實驗動物及分組：健康新西蘭家兔6只，體重（3.2～3.6）kg，雌雄不限（第四軍醫大學實驗動物中心提供），飼養于第四軍醫大學口腔醫院實驗動物中心的屏障環境。實驗組為脂肪組織復合基質血管成分組（AG+SVF），對照組為脂肪組織復合生理鹽水組（AG+NS）。以家兔右側耳朵移植區為實驗組，左側耳朵移植區為對照組，共計12個實驗部位。

1.3 移植方法：術前稱量新西蘭家兔體重并記錄，按照1ml/kg耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液。將家兔耳背部及背部肩胛區毛發剃除干凈，固定家兔，用0.5%的碘伏消毒背部肩胛區以及耳背部，在背部肩胛區中心距離頸部5cm處，做一長度約5～8cm的切口，切開全層皮膚。切取約（15±0.5）g脂肪組織[4]。用PBS沖洗脂肪組織2次，剔除血塊和結締組織，并剪成直徑約1mm3的脂肪顆粒，用生理鹽水離心清洗（200g， 2min），置于4℃冰箱備用。實驗組用無菌注射器吸取10ml脂肪顆粒置于50ml無菌三角燒杯中，加入0.25%的Ⅰ型膠原酶10ml，37℃恒溫振蕩50min[5-6]。再將消化后的脂肪懸液離心（600g，10min）。倒掉上層液體，用生理鹽水重懸浮，再次離心（600g，10min）。然后吸出上層液體，剩余約0.2ml沉淀物即為基質血管成分（SVF）。用骨膜分離器將家兔耳背部皮膚和軟骨之間分離直徑為3cm的圓形腔隙。用注射器吸取2ml清洗后的脂肪顆粒與0.2ml生理鹽水（NS），混合后采用18#注射針頭注入左耳移植區，作為對照組；吸取清洗后的脂肪顆粒2ml與0.2mlSVF混合后，采用相同的方法注入家兔右耳移植區域，作為實驗組[7]。

1.4檢測指標及方法

1.4.1 B超體積測量及游標卡尺體積測量：于術后當日、1月、3月和6月分別用B超和游標卡尺測量移植脂肪組織的縱徑、橫徑和厚度，采用體積計算公式：V=a×b×c×0.5(a為縱徑，b為橫徑、c為厚度)，分析移植脂肪組織的吸收變化情況[8]，脂肪組織存活率和吸收率分別采用下列公式計算：存活率（%）=術后時間點移植脂肪組織體積/移植當日脂肪組織體積，吸收率（%）=1-成活率[9]。

1.4.2 大體觀察：術后觀察移植區域的反應，有無感染、壞死等現象。取材后觀察移植物的外觀、體積、有無壞死等。

1.4.3 HE染色：在術后6個月將家兔實施安樂死，將移植的脂肪組織用4%的中性多聚甲醛固定，石蠟切片，進行常規HE染色，顯微鏡觀察組織結構及照相。

1.5統計學處理：采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。資料采用配對t檢驗比較兩組之間的差別，P<0.05，差異有統計學意義。

2結果

2.1 自體SVF對脂肪顆粒移植的作用：自體脂肪組織移植實驗12例，手術均成功，術區未見血腫及感染。脂肪組織內部未見明顯的壞死變性區域。實驗組與對照組在體積方面存在明顯的差異（見圖1）。

術后1、3、6個月，對照組（AG+NS）和實驗組（AG+SVF）隨著時間的延長，脂肪組織體積均有所吸收（見表1）。對照組術后1、3、6月脂肪組織存活率分別為：（64.35±8.36）%、（58.22±2.88）%、（50.61±9.47）%；實驗組術后1、3、6個月脂肪組織存活率分別為：（77.42±5.1）%、（67.95±6.09）%、（72.75±4.37）%。對照組脂肪組織隨著時間的延長而逐漸出現明顯的吸收；實驗組吸收緩慢，術后6個月脂肪組織的體積比術后3個月的體積有所增長（見圖2）。術后6個月實驗組、對照組移植脂肪組織的吸收率分別為（27.25±4.37）%和（49.39±9.47）%，比較有顯著性意義（P<0.05）。（見表1）

2.2移植脂肪組織HE染色觀察：術后6個月，移植脂肪組織HE染色結果顯示所有標本脂肪細胞呈圓形或多邊形，細胞中央有一大脂滴，胞質呈薄層，位于細胞周緣，包繞脂滴。未見炎癥、壞死等表現。實驗組與對照組在組織學方面未見明顯差異（見圖3）。

3討論

先天性畸形、外傷、腫瘤切除等常常造成口腔頜面部軟組織缺損。目前軟組織缺損修復的方法很多，如自體組織瓣修復、人工合成材料修復、自體脂肪組織移植[10]等等。然而，各種方法都存在不同的缺點，如供區損傷、排異反應、組織吸收等。其中自體脂肪組織抽吸注射移植是最常用的方法之一。它具有來源豐富、獲取方便、無排異反應、供區損傷小等特點。然而，自體脂肪組織抽吸注射移植的效果存在不可預知的吸收率（20%～90%）[1-2]，往往需要過度充填或重復注射2～3次，才能達到滿意的效果。因此，許多學者在這一領域展開大量的研究[1-2，4，11-14]，試圖找到解決這一難題的方法。

基質血管成分（SVF）主要包含成熟的脂肪細胞、脂肪前體細胞、脂肪來源的干細胞、成纖維細胞、各種血細胞等。研究表明，脂肪來源的SVF能夠向成骨、成軟骨、成脂肪、成血管、和神經等方向分化[15]。Daisuke Matsumoto等從綠色熒光蛋白大鼠腹股溝脂肪組織中提取SVF，與普通SD大鼠的脂肪組織相混合，然后移植到普通SD大鼠體內，來追蹤ADSCs的發展變化。結果表明，脂肪干細胞分化成了血管內皮細胞，并有助于脂肪移植過程中血管化的形成[16]。

本實驗制備自體脂肪來源的SVF與自體脂肪顆粒復合移植。結果表明，SVF能夠明顯改善移植脂肪組織成活的微環境。移植術后1～6個月連續觀察，實驗組移植脂肪成活率明顯提高（圖2），吸收率明顯下降（表1）。實驗組術后6個月脂肪組織體積較術后3個月有所增長，可能與SVF中脂肪來源干細胞向成熟的脂肪細胞方向分化有關。本課題組認為SVF中含有的脂肪來源的干細胞（ADSCs）在其中發揮重要的作用。一方面脂肪干細胞能夠向血管內皮細胞轉化，促進血管的形成，有利于移植脂肪組織的成活；另一方面脂肪干細胞在體內向成熟的脂肪細胞轉化，從而增加了移植脂肪組織的體積。

根據我們前期的實驗和有關參考文獻[7]，我們發現基質血管成分的含量與術后脂肪組織移植的體積的增長成正相關，如果加入基質血管成分過多，會使得術后脂肪組織的體積過度增長；加入基質血管成分太少，移植脂肪組織的體積達不到預期效果。我們采用從5份脂肪組織中獲取的基質血管成分加入到1份脂肪顆粒中，能夠取得較為理想的脂肪移植效果，使得移植6個月后脂肪組織的吸收率僅為（27.25±4.37）%，遠低于單純脂肪移植。

此外，從自體脂肪組織中提取SVF，不需要體外培養，直接應用于自體移植，具有成活率高、吸收率低、使用安全、制備簡便和價格低廉的優點。因此，應用自體SVF復合脂肪顆粒為制備軟組織修復材料提供了一種新的方法，并且為臨床軟組織缺損修復及整形美容開辟了廣闊的應用前景。

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[收稿日期]2010-11-16[修回日期]2011-02-21

編輯/張惠娟