組織工程與整形外科的研究進(jìn)展

隨著人口的增加，以治療疾病或替代損傷器官為主的生物醫(yī)學(xué)負(fù)擔(dān)仍然繼續(xù)加重。僅在美國(guó)，每年慢性疾病的醫(yī)療費(fèi)用就超過(guò)1.5萬(wàn)億美元，但其中的患者仍有70%死亡，每年有超過(guò)10萬(wàn)余人等待器官移植[1]，其中主要原因就是生物材料缺乏和不足。利用組織工程材料修復(fù)和重建正常組織的缺損和畸形一直以來(lái)都是整形外科工作者感興趣的問(wèn)題。現(xiàn)在人們不僅希望組織工程可以替換原器官，更期望可以恢復(fù)其生理功能，有關(guān)這方面的研究也在過(guò)去數(shù)十年得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步[2]。本文則簡(jiǎn)要概述組織工程在整形外科的應(yīng)用，并對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)行了展望。

1基本原則

“組織工程”一詞已經(jīng)出現(xiàn)了二十多年，組織工程學(xué)是綜合應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理、基本理論、基本技術(shù)和基本方法，在體外預(yù)先構(gòu)建一個(gè)有生物活性的假體，然后置入體內(nèi)，修復(fù)組織缺損，替代組織、器官的部分或全部功能，或作為一種體外成分，暫時(shí)替代器官部分功能，達(dá)到提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生命活動(dòng)的目的[3]。盡管隨著生命科學(xué)的進(jìn)步，組織工程得到了巨大進(jìn)步，但Langer和Vacanti于1993年提出的組織工程中的三個(gè)基本方法至今仍具有現(xiàn)實(shí)意義[4]。

實(shí)施組織工程的主要過(guò)程包括：①通過(guò)組織活檢獲得種子細(xì)胞，并采用體外分離、培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增和傳代的方法，得到足夠數(shù)量的細(xì)胞；②將種子細(xì)胞接種到一種生物相容性良好的支架上，形成細(xì)胞支架復(fù)合物；③將復(fù)合物置入人體，使支架材料逐漸被機(jī)體降解吸收，而種子細(xì)胞增殖分化取代原有的組織器官。由此可見(jiàn)，足量種子細(xì)胞的獲取、支架材料的選擇及參與細(xì)胞增殖分化的誘導(dǎo)和調(diào)控的細(xì)胞因子的應(yīng)用，便成為組織工程的三大主要環(huán)節(jié)。

1.1 種子細(xì)胞的獲取： 包括鑒別和分離出選定的具有增殖和修復(fù)、再生功能的細(xì)胞群。并采用體外分離、培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增和傳代的方法，得到足夠數(shù)量的細(xì)胞。組織工程使用的細(xì)胞多為干細(xì)胞，即具有全能性、可自我更新的細(xì)胞。目前，在人一生的各個(gè)階段和幾乎所有的成年組織都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞的存在[5]。研究比較多的干細(xì)胞包括：

1.1.1 胚胎干細(xì)胞：是一些來(lái)源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，具有最大潛能，可分化為三個(gè)胚層[6]。但對(duì)它的應(yīng)用，卻因倫理道德、移植后的免疫原性等方面的問(wèn)題而受到限制。

1.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞：是可以分化成中胚層的多能祖細(xì)胞。可最終分化形成脂肪、骨、軟骨、肌肉和血管等組織[7]。組織重建時(shí)的祖細(xì)胞也大多來(lái)自這些組織中。

1.1.3 造血干細(xì)胞：可以分化產(chǎn)生血液系統(tǒng)中的各種細(xì)胞及參與血管形成的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.1.4 組織特異性干細(xì)胞：也已在皮膚、肌肉、心臟、腦等處發(fā)現(xiàn)。最近，研究人員已經(jīng)利用基因誘導(dǎo)技術(shù)將成年人的細(xì)胞誘導(dǎo)成具有類(lèi)似干細(xì)胞功能的多能細(xì)胞。而且對(duì)于這些“去分化”細(xì)胞的使用，不涉及倫理道德問(wèn)題的限制。不過(guò)，這項(xiàng)新技術(shù)還需要更進(jìn)一步的研究才能應(yīng)用于臨床[8]。

1.2 細(xì)胞增殖分化的誘導(dǎo)和調(diào)控:干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化需要在特定的化學(xué)環(huán)境和外界環(huán)境中才能實(shí)現(xiàn)，目前，對(duì)于分離細(xì)胞的生物化學(xué)環(huán)境控制的研究已經(jīng)有了很大進(jìn)展，調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的許多生長(zhǎng)因子和合成小分子的濃度、空間結(jié)構(gòu)和時(shí)間相關(guān)性等都已經(jīng)確定。納米粒子傳遞和控釋微球作為通過(guò)病毒性和非病毒載體的藥物運(yùn)輸系統(tǒng)，和基因轉(zhuǎn)移已被用于概括組織形態(tài)發(fā)生發(fā)展的環(huán)境[9]。

1.3 支架材料:支架材料在組織工程研究中起著中心作用，隨著材料編織技術(shù)、生物力學(xué)技術(shù)、三維打印技術(shù)、影像學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)以及生物反應(yīng)器技術(shù)等各種現(xiàn)代技術(shù)的應(yīng)用，它不僅為特定的細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，而且還起到模板作用，引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)[10]。作為組織工程支架材料，必須具有三維多孔性及足夠的孔隙率，以便給種子細(xì)胞的種植和初始分裂提供足夠的空間。除此之外，組織工程的支架材料需要給組織發(fā)生提供一個(gè)細(xì)胞外環(huán)境，如：良好的生物相容性、降解速率的可調(diào)控性和良好的可塑性等。目前的支架材料主要有天然的支架材料、人工合成的支架材料以及復(fù)合材料。不過(guò)，由于天然替代品有限，合成生物材料越來(lái)越多地被用于高分子可降解支架的制造[11]。

組織工程中的這三個(gè)元素也可以說(shuō)是一種“種子和土壤”的關(guān)系，它包括了機(jī)械力、支架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子、氧張力等非細(xì)胞因素（即土壤）對(duì)干細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞這些“種子”的影響。在組織、器官的生成過(guò)程中能夠充分培養(yǎng)一個(gè)再生的環(huán)境時(shí)需要良好的種子細(xì)胞和周?chē)h(huán)境。

2特定的組織工程

目前，國(guó)際上把組織工程產(chǎn)品大致分為四類(lèi)：細(xì)胞類(lèi)(如干細(xì)胞、治療性克隆、微囊化細(xì)胞治療)、代謝類(lèi)(如生物人工肝、生物人工腎、生物人工胰腺)、結(jié)構(gòu)類(lèi)(如皮膚、心血管、骨骼肌)，以及其他類(lèi)型。比較成熟的產(chǎn)品有組織工程皮膚，并在臨床獲得應(yīng)用和組織工程軟骨。

2.1 皮膚:傳統(tǒng)的組織工程皮膚的制作方法是將角質(zhì)形成細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在天然或合成真皮支架上接種[4]。盡管根據(jù)這種方法已經(jīng)制作出幾種商業(yè)化的組織工程皮膚，但他們的長(zhǎng)期臨床效果一直因?yàn)闆](méi)有自身的祖細(xì)胞而欠佳。在毛囊、濾泡間細(xì)胞區(qū)域以及皮脂腺等處已發(fā)現(xiàn)存在許多皮膚干細(xì)胞，人們也已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這些細(xì)胞對(duì)皮膚穩(wěn)態(tài)的作用。基因治療也展示出對(duì)各種遺傳性皮膚病治療的可能，同時(shí)還可增加皮膚的再生能力[12]。近些年，已經(jīng)利用人的脂肪干細(xì)胞生產(chǎn)出含有表皮、真皮、皮下組織的皮膚，并誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞[13]。該研究說(shuō)明，皮膚細(xì)胞組織可以分化成為各種組織類(lèi)型。盡管取得了這些可喜的研究成果，但再生出具有完整功能的皮膚仍有很長(zhǎng)的路要走。角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的復(fù)雜旁分泌關(guān)系剛剛被人們認(rèn)識(shí)，他們和許多其他皮膚的物質(zhì)通過(guò)產(chǎn)生如機(jī)械感覺(jué)、體溫調(diào)節(jié)及色素生成等重要功能來(lái)維持皮膚的穩(wěn)態(tài)[14]。同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)是如何通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞的活性而產(chǎn)生可替代的皮膚，還需要進(jìn)一步研究。隨著日益多樣化的細(xì)胞群和生化信號(hào)研究，未來(lái)的組織工程皮膚很可能繼續(xù)采用在基質(zhì)上種植種子的方法。雖然，在關(guān)于皮膚的物理功能方面研究取得了很多進(jìn)展，但如何使皮膚產(chǎn)生眾多功能特性仍是組織工程學(xué)中令人感興趣的問(wèn)題。

2.2 脂肪：目前用于軟組織重建的方法是自體組織移植和人造埋植劑，但是卻受到組織吸收、埋植劑破裂或攣縮等多種問(wèn)題的限制[15]。然而，組織工程脂肪通過(guò)在具有生物相容性的支架上接種脂肪祖細(xì)胞解決了這些問(wèn)題。由于成熟的脂肪細(xì)胞增殖能力有限，最常用的細(xì)胞為前脂肪細(xì)胞和來(lái)自供體的脂肪組織和骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞。脂肪抽吸術(shù)和皮下脂肪切取術(shù)均可獲取足夠量的脂肪顆粒懸液或脂肪組織。因其含有大量的脂肪干細(xì)胞而在未來(lái)有較好前景。

除了移植后不易建立血運(yùn)，這一組織工程共同難題外，組織工程脂肪還面臨著外形和體積不穩(wěn)定的困難[16]。這方面接種干細(xì)胞的支架顯示出良好的優(yōu)勢(shì)，研究發(fā)現(xiàn)植入脂肪后可使其維持原形狀達(dá)4周[17]。將脂肪來(lái)源的干細(xì)胞添加到抽出的脂肪后再進(jìn)行脂肪移植，可以提高在大鼠模型上的組織存活率和血液供應(yīng)形成率，最近此技術(shù)用來(lái)以較少的劑量增加人類(lèi)乳腺癌組織[18]。未來(lái)臨床應(yīng)用的成功，將取決于精煉干細(xì)胞的獲取、分離技術(shù)和誘發(fā)脂肪的生物材料持久性的研究進(jìn)展。而且，由于脂肪干細(xì)胞的含量多、來(lái)源廣、多能的特點(diǎn)，預(yù)計(jì)將有越來(lái)越多的脂肪干細(xì)胞用來(lái)重建和形成其他間葉組織，如骨骼、肌肉、軟骨等。此外，它易建立血運(yùn)，可塑性強(qiáng)，使其在未來(lái)廣泛地用于構(gòu)建更為復(fù)雜的多組織結(jié)構(gòu)成為可能。

2.3 骨骼肌：除了普遍存在的細(xì)胞-基質(zhì)的作用機(jī)制之外，組織工程肌肉還面臨著復(fù)雜的微電子機(jī)械系統(tǒng)和機(jī)械網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的挑戰(zhàn)。直接注射供體的成肌細(xì)胞由于受多種限制而不能成功，最新的進(jìn)展是將成肌細(xì)胞或肌干細(xì)胞接種到組織工程支架上，在支架上采用機(jī)械刺激和電刺激提高他們分化為肌細(xì)胞的潛能[19]，增加骨骼肌功能的復(fù)雜性。為了增加組織工程肌肉中血管形成，研究人員在體外使用成肌細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的多元化體系，使組織工程肌肉提前形成血管。然后將這種骨骼肌結(jié)構(gòu)植入免疫缺陷的老鼠體內(nèi)，其整合、存活和血運(yùn)建立的結(jié)果均優(yōu)于不含這三種細(xì)胞的對(duì)照組[20]。這也同樣說(shuō)明，成肌細(xì)胞附著于支架上后在體內(nèi)分化成為骨骼肌的效果優(yōu)于直接將其注入體內(nèi)。

2.4 軟骨:軟骨是一種缺乏血供并且有與生俱來(lái)的自我修復(fù)機(jī)制的特殊組織。成熟的軟骨細(xì)胞在體外增殖能力和表型可變性都受到限制，因此目前的軟骨組織工程戰(zhàn)略側(cè)重于利用間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨祖細(xì)胞[21]。這兩種細(xì)胞均可使成纖維細(xì)胞脫分化，通過(guò)基因增強(qiáng)軟骨再生能力的實(shí)驗(yàn)已處于臨床前階段[22]。在體外利用接種多種種子細(xì)胞的支架已開(kāi)發(fā)出仿生軟骨結(jié)構(gòu)，植入到免疫抑制的小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)形成新軟骨[23]。目前，第一個(gè)生物工程軟骨已經(jīng)用于治療4例小耳畸形患者，從耳殘余部獲取軟骨細(xì)胞，在體外培養(yǎng)、傳代后植入下腹部，使其擴(kuò)大、生長(zhǎng)成熟。形成的軟骨組織在6個(gè)月后取出雕塑成耳的形狀，在術(shù)后2～5年隨訪過(guò)程中未出現(xiàn)組織吸收的現(xiàn)象[24]。

2.5 骨：盡管在組織工程骨的探索道路上有了很多嘗試，但是如何組合出最合適的種子細(xì)胞、支架材料和誘導(dǎo)信號(hào)以形成最好的組織工程骨還沒(méi)有解決。盡管許多細(xì)胞都表現(xiàn)出成骨潛能，如成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、骨骼細(xì)胞，但最有效的細(xì)胞類(lèi)型仍然未知。最近，在一項(xiàng)關(guān)于成年和胎兒干細(xì)胞成骨能力對(duì)比的研究顯示，兩者在急性股骨損傷的裸鼠模型上成骨能力無(wú)明顯差異。另一組在體外的模型實(shí)驗(yàn)中證明，成骨細(xì)胞植于支架之前可以被分化前期的間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)其分化作用[25]。此外，他們還報(bào)道了生物反應(yīng)器系統(tǒng)的改良成果，強(qiáng)調(diào)了在促進(jìn)骨形成時(shí)環(huán)境信號(hào)作用的重要性。

2001年，第1例自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞用于修復(fù)大的骨缺陷之后，另一個(gè)小組報(bào)道了使用含骨質(zhì)塊、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（BMP-7）和自體骨髓細(xì)胞的鈦支架采用二期手術(shù)方式修復(fù)了一個(gè)下頜骨缺損的病例[26]。將設(shè)計(jì)好的支架首先置入患者的背闊肌(來(lái)當(dāng)做原位誘導(dǎo)成骨生物反應(yīng)器）7周以后利用自由皮瓣來(lái)修補(bǔ)頜骨缺損。然而，大規(guī)模臨床研究前，還需要繼續(xù)調(diào)查確定最合適的細(xì)胞、支架、生物工程和分子信號(hào)的組合來(lái)獲得最佳的生物工程骨。

2.6 血管：血管移植在重建手術(shù)中經(jīng)常被用到，用于重建的血管主要有以下幾種：①自體同源移植，這類(lèi)材料經(jīng)常因?yàn)楣w不健康導(dǎo)致的病態(tài)而不可用，且費(fèi)用昂貴；②人工材料移植，這類(lèi)材料容易形成栓塞，生長(zhǎng)潛力和耐久性都比較差。基于干細(xì)胞的應(yīng)用已經(jīng)被用在血管構(gòu)造上，包括使用胚胎干細(xì)胞構(gòu)造小口徑血管（直徑＜6mm）以及使用原始內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)依次構(gòu)造內(nèi)皮層和肌纖維層[27]。基于細(xì)胞層的血管設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了完全自體同源的三層式血管的構(gòu)造，第1例生物工程血管用于構(gòu)建1例4歲女孩肺動(dòng)脈的臨床試驗(yàn)中[28]。血管生物反應(yīng)器很好地調(diào)控了血管生成中關(guān)鍵的機(jī)械信號(hào)和生理信號(hào)，同時(shí)在“連接動(dòng)靜脈的腔室循環(huán)模型”的體外生物反應(yīng)器中產(chǎn)生了血管化。另外，對(duì)于小口徑人造血管遠(yuǎn)期通暢率不高的問(wèn)題，我們科室正在嘗試用脂肪干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在血流沖擊下制作小口徑血管來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

2.7 周?chē)窠?jīng):治療神經(jīng)缺陷的替換選擇有自體同源移植（受限于供源稀少、供體不健康，易發(fā)神經(jīng)瘤和供受體不匹配），異源移植（受限于免疫排異反應(yīng)）以及非細(xì)胞材料移植（受限于再生延遲）。組織工程技術(shù)戰(zhàn)略有希望將原始神經(jīng)細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和其他生物材料合成，產(chǎn)生一種可行的替代品[29]。遍布全身的神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出良好的可塑性，而且使用Schwann細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的治療方法已經(jīng)在體外和動(dòng)物試驗(yàn)中取得了成功[30]。基因治療已經(jīng)表現(xiàn)出較大成功的可能，通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)因子的過(guò)表達(dá)，加強(qiáng)神經(jīng)再生的方法，但是在功能恢復(fù)的持久改善和病毒介導(dǎo)載體的基因傳遞的長(zhǎng)期結(jié)果還是未知的[31]。與其他復(fù)雜組織一樣，神經(jīng)缺損的修復(fù)也需要結(jié)構(gòu)和生化的信號(hào)精確協(xié)調(diào)，才能使神經(jīng)的生長(zhǎng)最終恢復(fù)功能。

3展望

一直以來(lái)，組織工程的組織和器官在整形外科領(lǐng)域發(fā)揮著不可或缺的角色。盡管在組織工程領(lǐng)域取得了很多進(jìn)展，但應(yīng)用于臨床仍然有很多困難。許多涉及材料學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物力學(xué)的基本問(wèn)題及基本現(xiàn)象還沒(méi)有搞清楚，例如：細(xì)胞在工程化基質(zhì)中如何實(shí)現(xiàn)功能、干細(xì)胞來(lái)源的產(chǎn)業(yè)化、生物力學(xué)在組織構(gòu)建過(guò)程中的具體作用及機(jī)理、細(xì)胞外基質(zhì)化可降解的支架材料等。另外，大器官的重建也仍舊受到血供有限的限制。這些問(wèn)題都值得整形外科的工作者去思考和探究。

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[收稿日期]2010-11-29 [修回日期]2011-02-16

編輯/李陽(yáng)利