中波紫外線對HaCaT細胞增殖活性的影響

[摘要]目的：探討中波紫外線（UVB）對HaCaT細胞損傷的影響。方法：取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，用0、30、60、90 mJ/cm2劑量的UVB照射后繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72h，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，用MTT法檢測UVB照射對細胞增殖活性的影響。結(jié)果：在30～60mJ/cm2的UVB輻射下，隨輻射劑量的增大，細胞的增值活性逐漸下降，而細胞的凋亡率逐漸增加，倒置相差顯微鏡從形態(tài)學(xué)上證實了細胞的凋亡改變。結(jié)論：UVB可誘導(dǎo)細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞]中波紫外線；輻射；HaCaT細胞；損傷

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0419-03

Effect of HaCaT cells proliferation by Ultraviolet-B Radiation

CHEN Chen1，SHI Yu-jie2，JIANG Zhen-you1， YANG Jian2

（1.School of Medicine， Jinan University， Guangzhou 510632，Guangdong，China; 2.Department of Dermatology， th e Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of damadge on HaCaT cells irradiated by Ultraviolet-B Radiation （UVB）(0、30、60、90mJ/cm2). MethodsThe dose- and time- dependent photodamage was observed by light microscopy. MTT assay was used to record cellular activity.Results The irradiation damage of HaCaT cells was dependent on the irradiated dosages (0、 30、60、90mJ/cm2). Conclusion UVB can induce damadge of HaCaT cells.

Key words: UVB; irradiation; HaCaT cells; damadge

皮膚是日光輻射直接作用的靶器官，紫外光按照波長的長短分為UVC(200～280nm)、UVB（280～315nm）、UVA（315～400nm），其中UVB是紫外光最少的一部分，雖然紫外光對人體是有益的，但大量的紫外光輻射，尤其是UVB，會對人體健康造成威脅[1]。筆者采用不同劑量的UVB對HaCaT細胞進行輻射，以MTT法檢測UVB照射對細胞增殖活性的影響，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1人角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）購自中國典藏培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)保藏中心），在DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）中培養(yǎng)。胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備：紫外光源（UVB燈管）為北京電光源研究所產(chǎn)品（功率8W，波長305nm）。UVB紫外線輻照計購自北京師范大學(xué)光電儀器廠。流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。紫外分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），CO2培養(yǎng)箱（Napco 5400，日本）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組和照光處理：取HaCaT細胞培養(yǎng)于含有體積分數(shù)10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、95%濕度及體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，經(jīng)0.5%胰蛋白酶+0.03%EDTA消化后用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基以1×105個/ml細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，當細胞融合80%以上且處于對數(shù)生長期，吸去各組培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗一次，并加入少量PBS覆蓋底面。用鋁箔紙做避光處理，解開需要處理的孔，用UVB進行照射，并以UVB輻射度監(jiān)視器標定照射強度，UVB劑量=UVB輻射度×?xí)r間（s）。培養(yǎng)板距燈管15cm，輻射總劑量分別為0、30、60、90mJ/cm2，照射完畢后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育至0h、24h、48h、72h。

1.2.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化：以劑量0、30、60、90mJ/cm2UVB輻射細胞，在照射后0h、24h、48h、72h以倒置顯微鏡觀察細胞損傷的形態(tài)變化。

1.2.3 MTT法測定HaCaT細胞增殖活性：將100μl密度為1×105 個/ml HaCaT細胞懸液接種于96孔內(nèi)，經(jīng)0、30、60、90mJ/cm2照射處理，每組6個復(fù)孔，繼之更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h，各孔加入MTT 10μl（濃度為5mg/ml），再孵育4h后棄去上清液，加入150μl二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩15min，于570nm波長測定每組吸光度（A）值，觀察各組細胞的增殖活性并繪制細胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：以SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差分析，當P﹤0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 UVB光損傷的形態(tài)學(xué)觀察 未經(jīng)照光處理的HaCaT細胞經(jīng)過一段適應(yīng)期貼壁后很快進入對數(shù)生長期，生長狀況良好，細胞呈典型上皮樣特征，呈鋪路石樣形態(tài)，高核漿比例，細胞排列緊密，輪廓清楚折光好。亞融合狀態(tài)的細胞接受不同劑量30、60、90mJ/cm2 UVB照射后24h受到不同程度的損傷，呈劑量依賴性，表現(xiàn)為細胞腫脹變圓、皺縮、細胞碎片增多，部分漂浮于培養(yǎng)液中。30mJ/cm2 UVB輻照后損傷變化最輕，細胞稍腫脹，部分脫落；60mJ/cm2 UVB輻照后細胞腫脹，部分壞死、脫落，部分細胞空泡變性、核固縮；90mJ/cm2 UVB輻照后細胞腫脹明顯，壞死、脫落較60mJ/cm2 UVB明顯（圖1）。當HaCaT細胞接收相同的輻射劑量30mJ/cm2 UVB照射后，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0h、24h、48h、72h時間點進行觀察，表現(xiàn)為細胞逐漸腫脹，出現(xiàn)核固縮，壞死，脫落（圖2）。

2.2不同劑量UVB 0、30、60、90mJ/cm2輻射HaCaT細胞24h后用MTT法測定HaCaT細胞增殖活性，經(jīng)t檢驗，30、60、90mJ/cm2 UVB組與0 mJ/cm2 UVB組相比較，各組P＜0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.3 30mJ/cm2 UVB輻射HaCaT細胞后分別在0h、24h、48h、72h時間點測定細胞增殖活性，未經(jīng)照光的HaCaT細胞具有良好的細胞增殖能力核較高的細胞活性，MTT法檢測顯示對照組細胞活性隨培養(yǎng)時間的增加而迅速增殖生長；而照光組細胞在照光后24h、48h、72h，MTT檢測均顯示細胞活性較對照組為低（t=4.974，P=0.001；t=17.634，P=0.000；t=26.042，P=0.000），且在長達72h的觀察過程中，細胞活性并無明顯回升（圖3）。

3討論

不同的紫外線對人體皮膚損害作用不同，其中UVB比UVA具有更強的誘變性和致癌性[2]。本研究采用UVB光源，以HaCaT細胞為輻射細胞，進行光損傷方面的研究。結(jié)果顯示，不同劑量UVB對細胞的損傷呈劑量依賴性，劑量越大，對細胞的損傷越重，細胞增殖活性隨照射劑量增大而下降，表現(xiàn)為細胞逐漸變圓、皺縮，懸浮細胞增多，碎片增多。在形態(tài)上進一步證實了UVB可誘導(dǎo)HaCaT細胞的凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)，在相同劑量的UVB輻射下繼續(xù)培養(yǎng)細胞，細胞增殖生長受抑制，而未照光對照組細胞生長狀況良好，很快進入對數(shù)生長期。30mJ/cm2的UVB照射劑量與Sittailo等建立UVB損傷模型時采用的計量相當[3]，此計量相當于海平面1～2min的日曬量，UVB到達地球表面時的輻射強度約為18～30mJ/cm2[4-6]。夏濟平等[7]發(fā)現(xiàn)，小劑量UVB輻照（210～420J/m2）能夠誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞凋亡，而較大劑量（1 260J/m2）的UVB照射可直接導(dǎo)致HaCaT細胞壞死。我們的研究從體外初步觀察了UVB照射對HaCaT細胞的影響，中波紫外誘導(dǎo)表皮細胞凋亡的藥物調(diào)控值得進一步研究。

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[收稿日期]2010-10-29 [修回日期]2011-02-12

編輯/張惠娟