骨髓間充質干細胞膜片復合磷酸三鈣陶瓷構建工程化骨組織的體內成骨研究

[摘要]目的：探討骨髓間充質干細胞膜片復合磷酸三鈣支架材料構建組織工程骨的可行性。方法：將兔骨髓間充質干細胞高密度接種于普通培養皿，在成骨誘導條件下連續培養2周，獲得細胞膜片，修剪成長方形，并由一端卷起包裹圓柱狀的磷酸三鈣材料。靜置孵育24h后將構建物移植到裸鼠背部皮下。術后6周取材，進行大體觀察、組織學檢查、組織定量學分析。結果：所獲骨髓間充質干細胞膜片有多層細胞組成，保留了細胞外基質。實驗組在材料表面及其孔隙內有較多的骨質形成；單一材料組空隙內為纖維組織，未見骨或軟骨樣組織；單一膜片組見片狀編織骨形成。 結論：骨髓間充質干細胞膜片在體內具有良好的成骨能力，可作為細胞釋放載體與磷酸三鈣支架復合構建骨組織。本研究為骨組織工程構建提供了新的方法。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；骨組織工程；細胞膜片；磷酸三鈣

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0408-03

Engineering bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell sheet and β-tricalcium phosphate ceramic

MA Dong-yang1，MA Jing2，JIANG Dong-hong3，WANG Jian-feng3

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，2. Department of Otolaryngology，3. Department of Medical Administration，Lanzhou General Hospital，Lanzhou Command，PLA，730052，Gansu，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) sheet and β-tricalcium phosphate ceramic (TCP).MethodsWe first harvested a cell sheet from rabbit BMSCs using a continuous culture method and a scraping technique. The cell sheet was then wraped around a cylinder of β-TCP. Finally，the constructs were implanted into the subcutaneous pockets of nude mice for in vivo experiments. Gross view and histological examinations were performed to evaluate the harvested specimens. Results The cell sheet， with an average thickness of 158 mm， was composed of multi-layered cells separated in the extracellular matrix. Six weeks after implantation， the new bone tissue was present both on the edge and at the center of the TCP in sheet-TCP group. A layer of woven bone formed in the cell-sheet group. In contrast， the TCP was filled only with fibrous tissue in the TCP group，without evidence of bone formation.ConclusionThe study indicates that the combination of osteogenic BMSC sheet and β-TCP ceramic can engineer bone tissue and the engineered construct might be considered as a promising substitute for bone repair.

Key words:bone mesenchymal stem cell; bone tissue engineering; cell sheet; β-tricalcium phosphate

近年來，隨著再生醫學的迅速發展，組織工程有望為骨缺損提供理想的修復方法[1]。組織工程骨的傳統構建方法是將具有成骨分化功能的種子細胞與三維支架材料復合[1-2]。細胞在體外擴增后常用胰蛋白酶消化成離散細胞懸液，在此過程中，細胞自分泌的細胞外基質、細胞-基質連接、以及細胞-細胞連接等結構都被破壞，而這些結構對于細胞分化、特異性表型維持、分泌、組織形成等功能非常重要[3]。再者，細胞與支架材料直接復合的方法存在細胞利用率低的缺點[4]。為了解決上述問題，我們提出新的組織工程構建策略，即應用細胞膜片與可降解的外源性支架材料復合來構建工程化骨組織。為驗證這一構想，本研究選用來源豐富、容易獲取、體外擴增速度快、安全實用性、無倫理學爭議的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell， BMSC)作為種子細胞來構建細胞膜片，同時選擇具有良好的生物相容性、可降解性、與松質骨的結構類似的多孔樣磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate， TCP)作為支架材料。

1材料和方法

1.1 材料：3月齡成年新西蘭大耳白兔，體重2.6～3.0kg，雌雄不限，由蘭州軍區總醫院動物中心提供。6周齡裸鼠(NIH strain， outbred) 購自中國科學院上海實驗動物中心。DMEM培養基（購自Gibco， Invitrogen Corp）；L－谷胺酰胺、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶（均購自美國Sigma公司，胎牛血清(杭州四季青公司)，CO2細胞培養箱(Forma公司3110Ⅱ，美國)，倒置顯微鏡及照相系統(Olympas IX71. A21PH， 日本)，離心機(Heraens Cryofuge 8000， 德國)，一型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs分離、培養、及細胞膜片構建：氯胺酮（10 mg/kg）肌內注射麻醉下，切取兔雙側髂骨并劈開，用含200 U/ml肝素的低糖DMEM沖洗髓腔、過濾骨髓、離心、棄上清、加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液，輕輕吹打成單細胞懸液，接種到直徑為10cm的普通培養皿里。加入含100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清、50mg/L抗壞血酸、0.27g/L L-谷胺酰胺的低糖DMEM，置于37℃、5% CO2的孵箱內培養，每隔2天更換培養液一次。當細胞達90%融合時，用0.25%胰酶消化后按1:3 傳代，換成含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，90%融合時再消化，按密度1×105個/cm2接種到直徑為10cm的培養皿。細胞融合后，更換為含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞水松，50mg/L抗壞血酸，10mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM條件培養液，每隔2 天換培養液1次，經2周的連續培養，用細胞刮刀由外周向中心沿底壁仔細刮起，獲得完整的細胞膜片[5]。

1.2.2 細胞膜片顯微結構觀察：隨機選取所獲細胞膜片，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，切成5μm厚切片，蘇木精－伊紅染色（HE）光鏡下觀察組織結構。部分膜片樣本經丙酮固定，鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色。部分膜片經2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脫水，干燥，噴金，掃描電子顯微鏡觀察標本表面形貌及層面結構。

1.2.3 體內試驗：實驗組將單層細胞膜片剪切成10mm×25mm的長方形狀（圖1A），并由一端卷起包裹預制成的TCP圓柱體（直徑0.8cm，高度1.0cm，70%孔隙率，平均孔徑450± 50μm，圖2A、B），靜置孵育24h后移植到裸鼠背部皮下。作為對照，相同大小的細胞膜片和同規格經成骨培養基孵育24h的單純材料也進行皮下移植。術后6周處死動物取材，進行大體觀察及組織形態學分析：①組織學定性分析：各樣本經石蠟包埋、切片后HE及Mallory 三色染色光鏡觀察；②組織學半定量分析：每組每例樣本連續4張5μm厚切片，橫貫整個樣本，Mallory 三色染色后由獨立的觀察者采用NIH Image J圖像分析系統在10倍鏡下分析切片中骨樣組織（磚紅色）與纖維組織（淡藍色）所占的面積百分比。每張切片隨機選取4個視野，計量后收集各組數據，取其平均值。

2結果

2.1 膜片的構建：融合BMSCs經過2周連續培養，皿底有透明乳白色薄膜樣物質形成，表面散在多個白色結節。用細胞刮沿皿底輕刮即可使其與培養皿底分離，刮起后膜片自行收縮，具有彈性和較穩定的機械性能，可以用鑷子或血管鉗進行鉗夾操作。HE染色，所獲膜片具有類似三維結構，由約8～10層細胞及細胞外基質組成，厚度平均158μm （圖1B）。掃描電鏡下觀察：膜片中細胞被細胞外基質包埋，基質表面可見礦化結節聚集（圖2C）。

2.2 體內實驗

2.2.1 移植6周后：實驗組和TCP組取材標本的形狀與移植前無明顯變化，但前者表面較硬，容易與周圍軟組織分離，后者表面被覆一層質軟的纖維組織，不易分離。膜片組見紙片狀硬質組織形成。

2.2.2 組織學結果：實驗組的外周表現為礦化程度較高的板層狀骨組織，可見致密骨基質、骨陷窩、骨細胞、成骨細胞等結構，材料內部的孔隙中央為纖維組織，周邊見低度礦化的小梁骨（圖3A、B、C）。組織定量學分析，骨與纖維組織的所占面積分別為22.5%和59.6%。單一TCP組孔隙內為纖維組織（面積比為76.1%），未見骨或軟骨樣組織。單純膜片組見片狀編織骨形成，致密的骨基質中可見類髓腔樣結構（圖3D）。

3討論

本研究證實了BMSC膜片與多孔TCP支架材料復合構建組織工程骨的可行性。與傳統方法相比，本研究應用的構建方法具有以下優點：①采用物理刮治的方法將體外擴增的細胞連同培養過程中自分泌的細胞外基質、形成的細胞基質連接一同收集，避免了傳統用胰蛋白酶消化的有創收集方法；②具有較高的細胞利用率。

細胞膜片技術由日科學家Okano等[6]發明，他們將溫度敏感性聚合物凝膠涂層于普通培養皿底壁制備出了溫敏性培養皿，在37℃時聚合物對其表面擴增融合的單層細胞膜片有絕對親和性，但降至其臨界溶液溫度32℃以下時，此聚合物對單層細胞膜片的親和性消失，使細胞膜片自動從培養皿底壁釋放。該培養技術避免了對細胞進行傳統胰蛋白酶消化等處理，進而保留了細胞自分泌的細胞外基質以及一些重要的細胞表面蛋白如離子通道、生長因子受體、細胞-細胞連接蛋白。利用此技術，角膜、皮膚、心肌、肝組織等多種細胞密集型軟組織已被成功構建[3]，但在用于骨組織方面的研究較少。2007年，Zhou等[4]首先報道用細胞膜片技術與復合離散細胞懸液的聚合物-陶瓷材料（磷酸三鈣-聚已酸內酯復合物）構建出組織工程骨；Gao等[7]則用多層細胞膜片與管狀珊瑚構建出管型骨。Okano等獲取膜片的技術操作程序較復雜，而且應用溫敏聚合物，可能會影響細胞的增殖分化。同時該技術獲得的膜片為單層細胞組成，厚度只有約10μm[8]。相比之下，我們的細胞膜片獲取方法簡單易行，無需特殊材料或者設備，而且由多層細胞及細胞外基質組成，厚度可達158μm，更像三維結構的組織。另外，一定的厚度賦予了膜片相應的彈性和較穩定的機械性能，增加了可操作性。本研究則用單層膜片與已用于臨床的人工骨替代材料TCP復合。

有趣的是，實驗組中，不僅在支架材料的外周有礦化程度較高的骨組織形成，而且在材料內部也可見相當數量的骨小梁。這一結果表明：作為細胞釋放載體系統，細胞膜片可賦予無機材料以生物活性。另一個有趣的結果是，與單純材料組相比，實驗組材料孔隙結構內的纖維組織量較少，意味著細胞膜片在促進成骨的同時阻止了纖維組織的張入，有望成為新型的具有生物活性的組織引導再生膜。

組織工程骨要取代自體骨移植大范圍應用于臨床，首先需要解決大體積支架內部細胞的氧氣、營養供應以及代謝產物排泄。種子細胞在體外依賴于培養介質提供營養，而植入到體內后，如同非血管化的游離骨移植，則需依靠受區組織液的彌散滲透作用獲得營養。然而，理論上體內環境通常所能提供的最大彌散距離是150～200μm，因此大體積復合物內相當數量的細胞因為無法獲取營養物質并排泄代謝產物而死亡[9-10]。盡管已有諸多方法可促進組織工程植入物與宿主血管網的緊密聯系，提高細胞成活率和組織修復功能，但目前為止，任何促進血管生長的方法都需要5～7天以上時間才能使植入細胞獲得血液供應，在這段時間內，細胞需從組織液中獲得足夠營養[10]。本實驗所應用的BMSC膜片厚度為 158μm左右，在有效組織彌散范圍內。我們推測將其植入體內后易于成活，有利于提高細胞治療的效率。

[參考文獻]

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[收稿日期]2010-12-06 [修回日期]2011-03-04

編輯/張惠娟