凝血酶對人皮膚成纖維細胞增殖作用的研究

[摘要]目的：觀察不同濃度的凝血酶對成纖維細胞的刺激作用，以及阿加曲班對這種刺激的抑制作用。方法：采用貼壁法進行人皮膚成纖維細胞原代培養，并傳代、鑒定。用MTT法檢測不同濃度凝血酶刺激后的成纖維細胞活力。用氯胺T法檢測不同濃度凝血酶刺激后的細胞上清中羥脯氨酸含量。用免疫組化的方法檢測凝血酶刺激后的成纖維細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達情況。在培養液中加入阿加曲班后重復上述檢測。結果：①培養的細胞為典型的成纖維細胞形態，波形蛋白單克隆抗體免疫組化染色呈陽性；②加入不同濃度凝血酶的各組吸光值均高于不加凝血酶組（A組）（P＜0.01），加入阿加曲班和凝血酶的各組吸光值與A組無顯著性差異（P＞0.05）；③加入不同濃度凝血酶的各組細胞上清中羥脯氨酸含量均高于不加凝血酶組（A組）（P＜0.01），加入阿加曲班和凝血酶的各組上清中羥脯氨酸含量與A組相比無統計學差異（P＞0.05）；④凝血酶刺激后的成纖維細胞中有α-SMA的表達，加入阿加曲班后此種表達被抑制。結論：凝血酶能誘導成纖維細胞增殖、膠原分泌量增加，能刺激成纖維細胞表達α-SMA，使成纖維細胞轉變為肌成纖維細胞。阿加曲班能抑制凝血酶的這種作用。

[關鍵詞]凝血酶；成纖維細胞；阿加曲班

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）03-0434-05

Study of thrombin on proliferation of fibroblasts isolated from mini pig's skin

XIE Xiang1，ZHUANG Hong-xing2，LI Dong3

(1.Shangdi Outpatient of the Third Hospital of Beijing University，Beijing 100084，China;2.Auricular Reconstructive Center ofPlastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Science， Peking Union Medical Collage， Beijing 100144，China;3.Department of Plastic Surgery，The Third Hospital of Beijing University，Beijing 100191，China）

Abstract:ObjectiveObserve the stimulatory functions of thrombin different concentration on fibroblasts， and the inhibitory actions of argatroban on the stimulatory functions.MethodsThe minipig skin fibroblasts were cultured in monolayer. The vigor of fibroblasts which were stimulated by different concentration of thrombin was detected by MTT. The contents of hydroxyproline in supernatant were detected by chloramines T method. The expressions of α-SMA in fibroblasts which were stimulated by thrombin， were detected by immunohistochemistry staining. After argatroban was infused into the culture solution， the detections mentioned above were repeated.Results① The cells appeared to be the typical fibroblast， the immunohistochemistry staining of α-SMA in the cells were positive. ②Compared with the group without thrombin， the OD value of the groups contained different concentration of thrombin were increased(P﹤0.01)， the OD value of the groups contained different concentration of thrombin and argatroban had no changes(P﹥0.05).③Compared with the group without thrombin， the hydroxyproline content in supernatant of the groups contained different concentration of thrombin were increased(P＜0.01)， the hydroxyproline content in supernatant of the groups contained different concentration of thrombin and argatroban had no changes (P＞0.05). ④α-SMA expressed in the fibroblast stimulated by thrombin. The expression of α-SMA was inhibited by argatroban.ConclusionsThrombin can induce fibroblast's proliferation， make fibroblast product more collagen，increase the expression of α-SMA in fibroblast，transform fibroblast to myofibroblast. Argatroban can inhibit these effects of thrombin.

Key words:thrombin;fibroblasts;argatroban

有研究表明血腫能造成擴張器外包膜增厚和乳房假體纖維包膜攣縮[1-2]。纖維包膜中的主要細胞是成纖維細胞，成纖維細胞分泌的膠原蛋白是纖維包膜的主要成分。這說明血腫中的某種成分可以刺激成纖維細胞增殖，使膠原分泌增加，并使包膜攣縮。有研究表明[3-5]凝血酶是成纖維細胞的促有絲分裂劑和化學引誘物，能使成纖維細胞的前膠原生成增加。本實驗用不同濃度的凝血酶刺激體外培養的人皮膚成纖維細胞，觀察成纖維細胞在凝血酶的作用下，細胞活力及其膠原合成能力的變化，并通過免疫組化染色觀察細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actinα-SMA）的表達情況。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗標本：標本取自整形外科患者手術中修剪掉的正常皮膚。

1.1.2 主要實驗試劑：胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，杭州四季青），DMEM（H）培養液（Hyclone），0.25%胰蛋白酶（Gibco BRL），青霉素－鏈霉素溶液（Hyclone），PBS緩沖液（Hyclone），羥脯氨酸(瑞士Fluka公司)，氯胺T(上海化學試劑公司)，二甲氨基苯甲醛(天津化學試劑研究所)，高氯酸(天津市東方化工廠)，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 （北京天來生物醫學科技有限公司），波形蛋白單克隆抗體（上海肯強儀器有限公司），SP法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司），α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（武漢博士德生物公司），凝血酶(Sigma公司)，阿加曲班（日本三菱制藥株式會社）。

1.1.3主要實驗設備：超凈工作臺（北京碧都空氣凈化設備公司），22560酶標儀（Biotrak，Austria），Soruau T21 高速冷凍離心機（Kendro，USA），3111細胞培養箱（Thermo Forma，USA），OLYMPUS TH4-200 倒置顯微鏡（OLYMPUS，Japan），Ultrospec 3300pro分光光度計（Biochrom，England）。

1.2 試驗方法

1.2.1人皮膚成纖維細胞的分離、培養

1.2.1.1人皮膚的取材：在無菌條件下將所取的正常人皮膚立即置入無血清的DMEM培養液中。

1.2.1.2人皮膚成纖維細胞的培養：在超凈工作臺內將皮膚置于培養皿中，常規處理后，放在 37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱，4h后將培養瓶緩慢放平，靜止培養。7天后在倒置相差顯微鏡下觀察，有成纖維細胞游離出，并進行傳代培養。

1.2.2 成纖維細胞的鑒定

1.2.2.1 形態學：用Olympus倒置顯微鏡觀察成纖維細胞的形態。

1.2.2.2 波形蛋白免疫組化：①細胞固定：取第二代生長狀態良好的成纖維細胞，用0.25%胰酶消化后接種于置有蓋玻片的6孔板中，待細胞爬滿后取出玻片，0.01M PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，0.01M PBS清洗5min×4次；②染色方法：按照北京中杉金橋生物技術有限公司產品SP-9000試劑盒提供的方法進行操作。鼠抗人波形蛋白單克隆抗體的工作液濃度為1:50。

1.2.3 MTT法檢測成纖維細胞活性：取對數生長期的成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞懸液，調整濃度為3×104/ml，接種于96孔板內，0.1ml/孔。置培養箱內孵育24h，待細胞完全貼壁后更換為含凝血酶(凝血酶粉劑溶解于生理鹽水中，-20℃貯存，濃度為1 000U/ml)和阿加曲班（1mg/ml）的培養液。共設9個組，分別為A、B、C、D、E、F、G、H、I組，每組設10個復孔：A組加入單純培養液，不加入凝血酶和阿加曲班；B、C、D、E組加入培養液的凝血酶終濃度分別為0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml；F組加入的培養液含阿加曲班10μg/ml；G、H、I組加入的培養液中，凝血酶終濃度分別為1U/ml、5U/ml、10U/ml，阿加曲班終濃度分別為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。置培養箱中孵育72h后，每孔加入10μl MTT(5mg/ml)繼續孵育4h，細胞內會產生深紫色的結晶，之后每孔加入100μl溶解液，孵育3～4h，直至鏡下觀察見深紫色結晶完全溶解。用酶標儀檢測570nm吸光度，吸光度值的大小反映成纖維細胞成活數量及活性。

1.2.4氯胺T法測上清中羥脯氨酸的含量[6]：取對數生長期的成纖維細胞，以0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液調整細胞濃度為3×104個/ml，按5ml/瓶接種于25cm2培養瓶內，24h后待細胞貼壁后，換成含有凝血酶和阿加曲班的培養液。共設9個組，分別為A、B、C、D、E、F、G、H、I組：A組加入單純培養液，不加入凝血酶和阿加曲班；B、C、D、E組加入培養液的凝血酶終濃度分別為0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml；F組加入的培養液含阿加曲班10μg/ml；G、H、I組加入的培養液中，凝血酶終濃度分別為1U/ml、5U/ml、10U/ml，阿加曲班終濃度分別為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。繼續培養72h。以0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液調整各組細胞濃度為1×104個/ml，按1ml/孔接種于24孔板，每組設8個復孔，8h后待細胞貼壁后換液，繼續培養72h。取上清液進行檢測。

取無細胞培養液作為空白組，排除外源性羥脯氨酸影響。檢測時將上清1ml加入有蓋試管中，加濃鹽酸1.2ml，110℃烘箱中水解2h，加40%氫氧化鈉1.2ml，加水稀釋至10ml，以1N鹽酸及1N氫氧化鈉調pH值至6.0，3 000 r/min離心10min，取上清液1ml，加水1ml、0.05mol/L氯胺T 1ml混勻。25℃水浴，充分振蕩2次，加1ml過氯酸，混勻，置5min，加10%二甲氨基苯甲醛1ml，混勻，100℃水浴2 min，冰水冷卻。用PU8800型分光光度計，在560 nm處比色，讀D值。以羥脯氨酸(HPr)標準液作標準曲線，得出樣品中羥脯氨酸的含量。

1.2.5 α-SMA抗體免疫組化染色：取對數生長期的成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞懸液，調整濃度為3×104/ml，接種于25cm2培養瓶中，每瓶5ml。置培養箱內孵育24h，待細胞完全貼壁后更換培養液，分為4組：A組培養液中不加凝血酶，孵育72h；B組培養液中凝血酶濃度1U/ml，孵育24h；C組培養液中凝血酶濃度1U/ml，孵育72h；D組培養液中凝血酶濃度1U/ml，阿加曲班濃度為1μg/ml，孵育72h。

1.2.6 細胞固定：成纖維細胞用0.25%胰酶消化后接種于置有蓋玻片的6孔板中，待細胞爬滿后取出玻片，0.01M PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，0.01M PBS清洗5min×4次。免疫組化染色方法同上，一抗為1:100的α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體。

2結果

2.1人皮膚成纖維細胞形態學觀察及鑒定

2.1.1倒置顯微鏡下觀察細胞呈長梭形，為典型的成纖維細胞形態，細胞大致呈平行排列，核較大，胞質較多。

2.1.2 人皮膚成纖維細胞波形蛋白單克隆抗體免疫組化染色結果，細胞呈陽性反應（見圖1）。

2.2MTT法檢測結果：加入不同濃度凝血酶的各組（B、C、D、E組）吸光值均高于不加凝血酶組（A組）（P﹤0.01），其中凝血酶濃度為1U/ml（C組）的吸光值最高，與其他組相比有顯著差異（P﹤0.01）。加入阿加曲班10μg/ml（F組）的吸光值與A組相比無統計學差異（P﹥0.05）。加入不同濃度的凝血酶和阿加曲班的各組（G、H、I組）吸光值組間無差異，與A組相比較無統計學差異（P﹥0.05）（見表1）。

2.3 氯胺T法測上清中羥脯氨酸含量結果：加入不同濃度的凝血酶的各組（B、C、D、E組）的上清中羥脯氨酸含量均高于不加凝血酶組（A組）（P﹤0.01），其中凝血酶濃度為1U/ml和5U/ml（C組和D組）的羥脯氨酸含量最高，與其他組相比較有顯著差異（P﹤0.05）。加入阿加曲班10μg/ml（F組）的羥脯氨酸含量與A組相比無統計學差異（P﹥0.05）。加入不同濃度的凝血酶和阿加曲班的各組（G、H、I組）羥脯氨酸含量與A組相比無統計學差異（P﹥0.05）（見表2）。

2.4 α-SMA抗體免疫組化染色結果：（見圖2）。

3討論

3.1 關于凝血酶的作用：凝血酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶，除了在血液凝固過程中起關鍵作用外，在組織修復和傷口愈合過程中也有很重要的作用。凝血酶是成纖維細胞的促有絲分裂劑和化學引誘物[3-5]。有學者證明濃度為1nM以上的凝血酶能刺激人胎兒肺成纖維細胞的前膠原生成增加，濃度為10nM的凝血酶能使前膠原生成增加60%～117%，并證明凝血酶的這種作用是通過PAR-1的蛋白水解激活而實現的[7]。Hewitso等用凝血酶刺激大鼠的腎間質成纖維細胞發現，0.1U/ml和0.5U/ml的凝血酶分別使培養的細胞數較對照組增多66%±41%和47%±41%，0.5U/ml的凝血酶使細胞的I型前膠原增多2.4倍[8]。

3.2 關于MTT和羥脯氨酸含量的檢測

3.2.1 本實驗用不同濃度的凝血酶刺激人皮膚成纖維細胞，觀察成纖維細胞活力、數量和膠原分泌能力的變化，并應用一種高活性的凝血酶抑制劑－阿加曲班，對凝血酶的作用進行干預，觀察阿加曲班抑制凝血酶的效果，并觀察阿加曲班對成纖維細胞的作用。

3.2.2 關于凝血酶在體外細胞培養實驗的用量問題，國內外文獻報道了0.1～40U/ml不等的用量。我們在實驗中選用濃度為0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml的凝血酶。阿加曲班是一種直接型凝血酶抑制劑，能快速、選擇性、可逆性的阻斷凝血酶的催化位點及非極性區，從而抑制凝血酶的作用。阿加曲班對凝血酶具有高度親和性，有研究表明[9]，阿加曲班阻斷50%游離凝血酶的濃度為1.1μmo1/L。根據這種換算方式，1ml液體中加入0.57μg的阿加曲班即可達到1.1μmo1/L的濃度，為了達到完全抑制凝血酶的效果，我們應用1μg/ml的阿加曲班來抑制1U/ml的凝血酶。

3.2.3 本實驗采用MTT法檢測細胞的數量和活力。實驗結果表明，加入不同濃度凝血酶的各組（B、C、D、E組）吸光值均高于不加凝血酶組（A組），其中凝血酶濃度為1U/ml（C組）的吸光值最高，與其他組相比有顯著差異。這說明凝血酶具有刺激成纖維細胞增殖的能力，當濃度為1U/ml時凝血酶的這種能力最強。加入不同濃度的凝血酶和阿加曲班的各組（G、H、I組）吸光值組間無差異，與A組相比無統計學差異。這一結果表明培養液中加入凝血酶抑制劑阿加曲班后，凝血酶的作用被抑制，失去了刺激細胞增殖的功能。單純加入阿加曲班10μg/ml（F組）的吸光值與A組相比無統計學差異，表明阿加曲班對人皮膚成纖維細胞既無刺激增殖的作用，也沒有抑制作用。

3.2.4 羥脯氨酸是合成膠原的特有材料，在膠原中的含量較為穩定，因此在臨床和實驗中，膠原總量的測定常采用羥脯氨酸法，間接反映總膠原蛋白含量[10]。我們應用氯胺T法檢測培養液上清中羥脯氨酸含量，以檢測成纖維細胞分泌膠原蛋白的能力。本實驗的設計是先以不同濃度的凝血酶刺激細胞，然后再取數量相等的細胞在不含凝血酶的培養液中培養72h后，檢測上清中的羥脯氨酸含量，這樣可以排除凝血酶刺激細胞增殖的影響，檢測受到不同濃度凝血酶刺激后的數量相同的細胞膠原蛋白分泌量。實驗結果表明使用不同濃度凝血酶的各組（B、C、D、E組）上清中羥脯氨酸含量均高于不加凝血酶組（A組），其中凝血酶濃度為1U/ml和5U/ml（C組和D組）的羥脯氨酸含量最高，與其他組相比有顯著差異。這一結果表明凝血酶刺激后的成纖維細胞，在沒有凝血酶的環境中仍有較高的膠原分泌量。含有不同濃度凝血酶和阿加曲班的各組（G、H、I組）羥脯氨酸含量與A組相比無統計學差異。這說明阿加曲班抑制了凝血酶的作用，使凝血酶失去了刺激細胞增加膠原分泌的能力。含有阿加曲班10μg/ml的F組羥脯氨酸含量與A組相比無統計學差異，這顯示阿加曲班對成纖維細胞的膠原分泌無明顯作用。

3.3 關于凝血酶刺激α-SMA的表達：在很多關于纖維變性病變的文獻中，把表達α-SMA的成纖維細胞稱為肌成纖維細胞(myofibroblast， MF)[11-13]。MF胞胞漿內含有大量的微絲，具有平滑肌細胞的收縮能力，是創面收縮的動力細胞[14]。擴張器周圍的纖維囊壁中含有大量的MF，MF的收縮活性不僅會使組織擴張的進程減慢，而且還會使擴張后的組織回縮率增高，影響實際的擴張面積和手術應達到的預期效果。體外培養也證實[15]，成纖維細胞可以受刺激分化，獲得表達α- SMA的能力而成為MF。關于凝血酶是否能刺激成纖維細胞使其表達α-SMA，尚存在爭議。Galina S Bogatkevich等[16]的研究表明凝血酶刺激正常肺成纖維細胞表達α-SMA，變為肌成纖維細胞表型，并證明凝血酶的這種作用是通過蛋白激酶C信號轉導途徑實現的。而Hewitso用凝血酶刺激大鼠的腎間質成纖維細胞沒有發現細胞中α-SMA表達的變化[8]。本研究用1U/ml的凝血酶刺激成纖維細胞，應用免疫組化的方法證明受到凝血酶刺激的細胞胞漿內有α-SMA的表達，而且這種表達是隨刺激時間延長而增強的。加入阿加曲班的D組細胞內只有極弱的α-SMA表達，這說明阿加曲班抑制了凝血酶的作用，抑制了α-SMA的表達。

本實驗證實了體外培養的人皮膚成纖維細胞受到一定濃度凝血酶刺激后，膠原分泌量增加，細胞漿內有平滑肌肌動蛋白表達。在體內，血腫形成后會產生大量凝血酶，血液凝固時產生的一些與纖維蛋白結合的凝血酶可持續存在于血腫內，并可緩慢釋放到周圍的組織中[17]。依據本實驗結果，我們可以推論這些血腫形成后被釋放出的凝血酶會持續刺激血腫周圍組織的成纖維細胞增殖，產生大量膠原蛋白，并使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞。本實驗的結果可作為進一步研究血腫對皮瓣毒性作用的基礎。

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[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2011-02-14

編輯/張惠娟