缺血后處理對保護皮瓣的作用機制研究

[摘要]目的：缺血后處理已經在心、腎等器官上廣泛應用，進行相關研究進一步探究缺血后處理對皮瓣有否保護作用。方法：健康成年新西蘭大白兔，分為3組。A組為給予缺血后處理；B組為再灌注前5min給予A2A阻滯劑 SCH58261+缺血后處理。C組，直接應用微血管夾阻斷腹壁淺血管持續缺血6h后，恢復正常血供。分別進行中性粒細胞浸潤，MPO含量和皮瓣存活率檢測。結果：新西蘭大白兔完全存活。B、C組相比較，中性粒細胞計數以及MPO含量也未見統計學差別（P>0.005）。實驗組皮瓣存活面積比較，B與C相比較，無統計學意義(P>0.005），但是A與B、C相比較，上述指標兩兩之間都有統計學意義差別(P<0.005）。結論：缺血后處理對皮瓣再灌注損傷有保護作用，該作用可能和A2A受體性質有關。

[關鍵詞]：皮瓣；缺血-再灌注損傷；A2A受體

[中圖分類號]R622[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）03-0416-03

Study of the mechanism on the ischemia postconditioning for the protection of the skin flap

LIN Huang，DONG Yong

(Department of Plastic Surgery， Anzhen Hospital，Capital University of Medical Science，Beijing 100029，China)

Abstract:ObjectiveThe ischemia postconditioning is widely used for the protection of the heart， kidney， a further study is done to explore the protection of the ischemia postconditioning on the skin flap.MethodsThe adult newzlend rabbits are divided into 3 group.A group is provided with ischemia postconiditoning; B group is provided with A2A inhibitor SCH58261 plus ischemia postconditioning. C group is provided with direct ischemia with microvascular clamp.The study includes neutrophil cell infiltration，content of MPO and the survival of skin flap.ConclusionThe rabbits all survived .No difference existed between B and C group about neutrophil count and content of MPO（P>0.005）.No difference was found about the skin flap survival. But about the above three parameters，A group was found to have significance between B and C group.ConclusionIschemia postconditioning can protect the skin flap which may be attributed to the role of the A2A receptor.

Key words:skin flap;ischemia-reperfusion injury;A2A receptor

自2003年Zhao 等提出缺血后處理( ischemiapostconditioning) 的概念以來，缺血后處理提高組織對缺血的耐受性、減輕組織缺血再灌注損傷的作用已在全身的多個器官通過動物和臨床的證據證實[1-3]。但是缺血后處理對皮瓣作用尚未經證實，進行相關研究探究缺血后處理對皮瓣的保護作用。

1材料和方法

1.1 動物模型的建立：選用健康成年新西蘭大白兔32只，雌雄不限，體重2.5～3.5kg。腹腔內注射異戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于實驗臺上，腹部備皮，制備左側腹股溝皮瓣約4cm×8cm，保留腹壁淺血管備用。

1.2 實驗方法與分組：模型建立后，實驗動物隨機分為3組。對照組為C組，直接應用微血管夾阻斷腹壁淺血管持續缺血6h后，恢復正常血供；實驗組持續缺血恢復灌注后即給予短暫的缺血再灌注處理（10s缺血+10s再灌注為一個療程，共6個療程，持續2min）。根據處理方式的不同分為2個亞組：A組為給予缺血后處理；B組為再灌注前5min給予腹壁淺靜脈給予A2A阻滯劑 SCH58261 10mg缺血后處理。各組處理后實驗步驟與對照組相同；每組8只。實驗期間，烤燈保溫，無明顯血管痙攣現象。

1.3 標本收集與檢測：每組兔子恢復血流4h后， 取2只處死，切取皮瓣組織(1～2g)標本用4% 甲醛固定，HE 染色鏡下觀察。病理切片分析，200倍視野下計數中性粒細胞浸潤數目，每組計數2張切片，每片計數10個視野。將皮瓣按重量體積比例制備成組織勻漿，按照試劑盒說明書進行具體步驟操作，采用分光光度法在460nm處檢測各管OD 值，運用公式（測定管OD 值-對照管OD值/11.3×取樣量）計算MPO活性數值。其余6 只動物于術后第7 天判斷皮瓣成活情況，計算皮瓣成活面積的百分比。

1.4 統計學方法：采用SPSS1110 統計軟件包進行統計學處理， 數據以均數±標準差表示。實驗組與對照組比較采用t檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1 大體觀察：手術中和手術后1周內所有的新西蘭大白兔均存活。皮瓣恢復血流灌注24h內， C組皮瓣遠端大部分組織迅速腫脹淤紫，指壓毛細血管無反應，以后皮瓣兩邊逐漸變黑。術后6～7天壞死界限清晰。A實驗組皮瓣兩側邊緣部分出現腫脹，色澤偏暗，指壓毛細血管回流稍遲緩，最終僅兩側邊緣部分皮瓣組織壞死。B、C組變化程度相近。

2.2 組織學觀察：皮瓣恢復血供4 h后，大體觀察各組無明顯差異。光鏡下見B、C組HE染色變淺，胞核腫脹淡染，炎性細胞浸潤真皮；A組染色均一，結構尚完整，胞核呈梭形，炎性細胞浸潤少。

2.3 皮瓣浸潤中性粒細胞計數和皮瓣組織MPO含量：B、C組相比較，中性粒細胞計數以及MPO含量也未見統計學差別（P>0.05）。但是A與B、C相比較，兩兩之間都有統計學意義差別（P<0.05）（見表1和圖1、2）。

2.4 皮瓣成活面積：實驗組A和B 與C相比較，均有統計學意義（P<0.05），皮瓣成活面積提高了一倍左右。但是B和C組相比較，成活面積改變不明顯，差別無統計學意義（P>0.05）（見表2和圖3）。

3討論

3.1 如何預防和減輕組織缺血再灌注損傷是當前醫學研究的重要課題之一。缺血后處理通過一次或多次短暫缺血，再灌注過程而減輕組織缺血再灌注損傷的發生應用于再灌注早期的新的機械性干預措施，具有可預知性和可控制性的特點，而且其在臨床上應用簡單、方便、可行， 易為外科醫生所接受。雖然缺血后處理在心，肝和腎中作用已被廣泛證實[4-7]。但是對皮瓣保護作用仍然尚未證實。

3.2 缺血再灌注損傷的進一步研究認為再灌注損傷本質是炎癥反應，是內源性的細胞因子和炎性介質等引起的級聯式炎癥反應。通過信號分子的逐級轉導，炎癥反應瀑布型放大，引起再灌注損傷的迅速加重直至衰竭。在再灌注損傷初期中斷炎癥反應的發生成為保護組織的關鍵。缺血后處理對組織保護作用機制目前被廣泛研究，其中涉及到機制有：①抑制細胞凋亡學說。細胞凋亡主要通過兩條途徑， 即死亡受體途徑和線粒體途徑。沈誠發現缺血后處理的心肌細胞能耐受缺血缺氧的損傷，心肌細胞的凋亡指數明顯降低[8]；②自由基清除：萬芳發現后適應能升高腦缺血再灌注大鼠腦勻漿中SOD，還原型谷胱甘肽( reduced glutath ione，GSH)含量，加快清除組織超氧陰離子自由基，使脂質過氧化產物丙二醛含量顯著下降[9]；③改善微循環：缺血后適應后血流灌注量增加， 細動靜脈收縮、血流速度減慢和白細胞滾動、貼壁程度減輕[10]。

3.3 我們的研究著重探討缺血后處理對新西蘭大白兔腹股溝皮瓣再灌注損傷的影響并且研究A2A受體在缺血后處理保護皮瓣機制中作用。A2A受體活化被認為是機體內一種最有力的內源性抗炎信號，它大量表達于單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、中性粒細胞、內皮細胞、嗜酸粒細胞、上皮細胞，以及淋巴細胞、自然殺傷細胞和自然殺傷T細胞。A2A受體活化能夠抑制免疫應答過程早期和末期反應，包括抗原提呈、共刺激、免疫細胞轉運及增殖、致炎細胞因子釋放和細胞毒性反應，腺苷A2A 受體抗炎軸能被用作治療缺血性和炎癥性組織損傷的內源性手段[11-12]。

3.4 我們測定了各組皮瓣組織中MPO 的含量和中性粒細胞浸潤程度。中性粒細胞黏附和浸潤是皮瓣缺血后炎癥反應的核心。MPO 是中性粒細胞嗜天青顆粒產生的一種重要的過氧化物酶，主要存在于中性粒細胞中，可作為中性粒細胞的特異性標記物，利用其可使過氧化氫還原的能力分析該酶的活力，既可定量測定中性粒細胞的數目，反映中性粒細胞的浸潤情況，又可定量反映炎性損傷的程度。

A組中中性粒細胞計數和MPO含量明顯高于B和C組。皮瓣的成活面積也增加。顯示缺血后處理對腹股溝皮瓣有效，而且這種保護皮瓣作用可被A2A受體阻滯劑阻斷，顯示缺血后處理保護作用和A2A受體有關。A2A受體作用可能和其抗炎作用有關。但是具體保護機制尚不清楚，還有待進一步研究。

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[收稿日期]2010-11-28 [修回日期]2011-02-22

編輯/張惠娟