正交試驗探討五靈膠囊配伍對慢性肝損傷小鼠的影響

瞿新紅， 王勝春， 皇甫娟， 田衛斌

(第四軍醫大學西京醫院藥劑科，陜西西安710032)

中醫方劑，或中藥復方，是中醫用藥的主要形式與特色，因為它是中醫辨證施治的具體體現和實施方式，因而復方中藥配伍理論是中醫藥理論的基礎［1-2］，開展方劑配伍規律的現代研究對于繼承和發展中藥配伍理論發揮臨床價值有著重要意義［3-4］，也能更有效地指導臨床，為中藥新藥研制提供依據。五靈膠囊(國藥準字Z20090068)是由五味子、丹參、柴胡、靈芝制成的復方制劑，具有疏肝、益脾、活血功能，用于肝郁脾虛狹瘀癥，臨床用于乙型慢性肝炎治療［5-7］。處方來源于經驗方，臨床應用33年。本試驗采用正交設計對五靈膠囊不同配伍進行動物試驗，從藥效學方面探討五靈膠囊配伍的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 藥材:柴胡Bupleurum chinense DC(陜西白水產)，北五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill(河北承德產)，丹參Salvia miltiorrhiza Bge(陜西商洛產)，靈芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst(河南蘆氏栽培品種)。試劑:膽堿酯酶(CHE)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(北京中生公司);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。動物:昆明種小白鼠，♂性，體重(20±2)g，由第四軍醫大學動物中心提供，動物合格證號:SC×K(軍)2002-05;儀器:半自動生化儀(MD-100型)。

1.2 方法 取昆明小鼠170只，隨機分為17組，置溫度(25±1)℃，相對濕度(40% ～65%)的實驗室，適應環境3 d后試驗。正常組小鼠皮下注射生理鹽水2 mL/kg，其余各組小鼠皮下注射20%CCl4香油溶液2 mL/kg，每3 d注射1次。第3次注射后，正常、模型組灌胃蒸餾水10 mL/kg，其余各組分別給予相應受試藥物，給藥劑量均相當于生藥10 g/kg，連續給藥10 d，同時各實驗組小鼠每3 d繼續皮下注射20%CCl4香油溶液2 mL/kg，正常組小鼠皮下注射生理鹽水。末次給藥后，禁食過夜，眼眶取血，離心，取血清測定ALT;取肝組織用預冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，置冰浴中勻化制得10%的肝勻漿，4℃12 000 r/min離心20 min，取上清測定MDA、CHE。

2 結果及分析

2.1 正交設計 選藥物五味子(A)、丹參(B)、柴胡(C)、靈芝(D)為交互配伍的主要因素，對上述因素各取2水平，選用藥為(1)，不選用藥為(2)，因素水平安排見表1。

2.2 正交設計與結果 按正交表L16(215)安排試驗，取處方量五味子、丹參、柴胡、靈芝交互配伍，加10倍量乙醇回流2次，每次1 h，濾過，合并2次濾液，回收乙醇，減壓濃縮成稠膏。按上述1.2項方法進行藥效學試驗，結果見表2～3。

表1 因素水平

2.3 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠MDA影響結果分析 本試驗中并未設置誤差項，故將S值最小的因素B作為誤差項，結果另外14組因素全部顯著，提示正交試驗沒有意義。隨后合并S值較小的4項B、C、BD、ABD作為誤差項，其自由度為4，以F值檢驗作為判斷指標，除配伍組A(五味子)和ABC(五味子+丹參+柴胡)無顯著性，其它配伍組均顯著或高度顯著。由于本試驗要求各試驗組有降低慢性肝損傷小鼠MDA的作用，故要求K1＜K2，即R值為負數有降低MDA作用，且負值越大效果越好。實驗組 D、AD、CD、ACD、BCD、ABCD 的R值為負，說明單味靈芝，五味子+靈芝，柴胡+靈芝，五味子+柴胡+靈芝，丹參+柴胡+靈芝及全方能降低慢性肝損傷小鼠肝組織MDA值，其降MDA作用順序為CD＞D＞BCD＞AD＞ABCD＞ACD。其余4配伍組 AB、AC、BC、ABC的 R值為正，則沒有降MDA的作用，結果見表4。

表2 正交試驗設計與結果(n=10)U/L

表3 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠ALT、CHE、MDA的影響 (n=10)

表4 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝MDA的影響(方差分析)

2.4 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝ALT影響結果分析 合并S值較小的5項作為誤差項，其自由度為5，以F值檢驗作為判斷指標，除配伍組B(丹參)，BC(丹參+柴胡)無顯著性，其它配伍組均顯著或高度顯著。由于本試驗要求各配伍組有降低慢性肝損傷小鼠ALT酶的作用，故要求K1＜K2，即R值為負數時有效，且負值越大降酶效果越好。而配伍組 A、B、C、ABC、ABCD得R值為負，說明這5組配伍均有降低ALT酶的作用，但配伍組B(丹參)無顯著性，故丹參對降低小鼠ALT酶作用不顯著，其余4配伍組降ALT酶的作用順序為A ＞ABC ＞ ABCD ＞ C。另外，配伍組AC、BC、D、ACD、BCD的R值為正，說明這5組配伍升高小鼠肝ALT值，結果見表5。

表5 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝ALT酶的影響(方差分析)

2.5 藥物不同配伍對CCl4所致小鼠慢性肝損傷CHE影響的結果分析 合并S值較小的5項作為誤差項，以F值檢驗作為判斷指標，除配伍組AB(五味子+丹參)無顯著性，其余配伍組均高度顯著。由于本試驗要求各配伍組有升高慢性肝損傷小鼠CHE酶的作用，故要求K1＞K2，即R值為正顯示有效，且正值愈大藥效作用愈強，故只有配伍組A、B、CD、BCD、ABCD能升高慢性肝損傷小鼠 CHE酶，其作用順序為A＞ABCD＞BCD ＞B＞CD，其余配伍組C、BC、AD、ABD的R值為負，說明這4組配伍降低慢性肝損傷小鼠CHE酶，結果見表6。

表6 藥物不同配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝CHE酶的影響(方差分析)

2.6 驗證 取小鼠50只，分為正常組、模型組、配伍BC組、配伍ABC組和全方組，每組10只，小鼠按上述1.2項下試驗方法制備慢性肝損傷模型，各試驗組給藥方法及劑量同上。結果:與正常組比較，模型組ALT與MDA顯著升高，CHE顯著降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。與模型組比較，配伍BC組明顯降低ALT，顯著升高CHE(P ＜ 0.01，P ＜0.05);配伍ABC組顯著降低ALT，升高CHE與MDA;全方組顯著降低ALT與MDA，升高CHE(P ＜0.01，P＜0.05)，見表7。

3 討論

采用正交設計法研究五靈膠囊各組分交互配伍對CCl4所致慢性肝損傷小鼠MDA、ALT和CHE酶水平的影響，旨在明確4種組分交互配伍后藥效作用的意義和組方合理性。本試驗中五味子、丹參、柴胡、靈芝是交互配伍的主要因素，按L16(215)正交列表安排試驗，同一提取條件和給藥劑量，測定指標為血清ALT酶水平與肝勻漿MDA值和CHE酶水平，每一試驗組受試慢性肝損傷小鼠10只，采用數據取均值，15組配伍方測定結果以F值檢驗［8-9］顯著性差異(P ＜0.01，P ＜0.05)。CCl4所致慢性肝損傷小鼠肝組織MDA增加、ALT酶水平升高和CHE酶水平下降，能夠清除MDA、降ALT酶或升高CHE酶水平的因素為有效因素。就MDA和ALT而言即R值為負且負值愈大，清除自由基和降酶效果愈好，反之則沒有作用;而CHE酶的R值偏向正數愈大，說明肝功能修復作用愈強。試驗分析結果顯示:因素D有清除慢性肝損傷小鼠肝組織自由基作用(P＜0.01)，而因素A(五味子)與因素C則無此作用，但當靈芝配伍五味子或柴胡，能增強五味子和柴胡清除肝組織自由基的作用;五味子配伍丹參、柴胡無清除肝自由基作用;丹參+柴胡，五味子+丹參+柴胡也沒有降低MDA的作用，因為這5配伍組的R值為正，丹參+柴胡+靈芝和全方有顯著降MDA作用。慢性肝損傷小鼠肝細胞壞死導致ALT明顯升高，五味子、柴胡對慢性肝損傷小鼠血清ALT酶有明顯降低作用(P＜0.05)，但二者配伍后五味子+柴胡降ALT酶作用顯著減弱;靈芝無降低慢性肝損傷小鼠血清ALT酶作用，丹參有較弱的降低ALT酶作用;全方和五味子+丹參+柴胡配伍組有明顯降低ALT酶。慢性肝損傷小鼠肝細胞壞死導致肝功能下降，其肝臟合成功能標志酶CHE降低，CHE合成增加意味著肝臟功能改善。五味子、丹參有升高CHE酶的作用(P ＜0.01)，但二者配伍后反而無升高CHE酶作用;柴胡、靈芝無增加CHE合成作用，柴胡 +靈芝配伍能顯著升高 CHE酶(P ＜0.01);五味子+丹參+靈芝配伍組無升高CHE酶作用，而全方和丹參+柴胡+靈芝配伍組均能升高CHE酶(P ＜0.01)。驗證結果顯示:配伍BC組可降低ALT，升高CHE;配伍ABC組顯著降低ALT，升高CHE與 MDA;全方組降低 ALT與 MDA，升高CHE，與正交試驗結果趨勢一致。在此實驗條件下五靈膠囊配伍是合理的，綜合分析相對最佳因素為全方，既降低MDA與ALT酶活性，又增加CHE酶活性。

表7 各配伍組對CCl4所致小鼠慢性肝損傷酶活性的影響 (±s，n=4)

表7 各配伍組對CCl4所致小鼠慢性肝損傷酶活性的影響 (±s，n=4)

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量/(g/kg)血清ALT/(U/L)肝勻漿CHE/(U/L) MDA 值正常組 10 mL 7.15±2.11** 89.76±11.3** 94.98±10.37*模型組 10 mL 39.39±10.60 30.00±9.35 128.50±21.07 BC組 10 g 25.81±8.67* 101.40±19.20** 133.20±41.89 ABC組 10 g 12.38±7.49** 70.49±24.16** 162.50±31.58*全方組 10 g 10.90±2.66** 61.75±36.85** 71.15±8.73**

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