甘草總皂苷的提取純化工藝研究

朱中佳， 熊富良， 張雪瓊， 馮井慶， 高文天

(武漢理工大學化學工程學院，湖北武漢 430070)

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根及根莖，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的功能［1］。甘草的主要成分為甘草酸等三萜皂苷和甘草苷為主的甘草黃酮。甘草中三萜類皂苷具有含量高、生理活性強的特點，不僅具有抗潰瘍、消炎、解毒等生理活性，近年研究還發現具有抗病毒、抗癌活性［2］。而日本采用甘草總皂苷治療慢性乙肝已有20多年的歷史［3］。因此探討甘草的提取和純化工藝具有十分重要的意義。甘草中有效成分的提取方法包括水提取法［4］、索氏提取法［5］、超高壓法［6］、微波輔助提取法［7］、超聲波提取法［8］和超臨界 CO2萃取法［9］等。而正交試驗設計在優化甘草提取工藝中應用廣泛［10－11］。甘草中有效成分的純化方法則主要為大孔吸附樹脂法［12－13］。本試驗采用水提取法提取甘草總皂苷并采用正交試驗法對其工藝進行了優選，接著以HPD系列的大孔樹脂純化了甘草總皂苷。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀;UV1101型紫外分光光度儀，JA2003N型分析天平，AS5150A型超聲波清洗器，DHG－9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

HPD－100、HPD－300、HPD－700、HPD－722 和 D－101 型大孔吸附樹脂由河北滄州寶恩化工有限公司提供。甘草酸單銨鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所)，甘草購自武漢市神草中藥飲片有限責任公司，由武漢理工大學化工學院劉小平教授鑒定。所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 分析方法

2.1.1 甘草中甘草酸含量測定方法(HPLC)

色譜條件:Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm;5 μm);檢測波長:250 nm;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;流動相為甲醇－0.2 mol/L醋酸銨溶液－冰醋酸(67∶33∶1)。

對照品溶液的制備:取甘草酸單銨鹽對照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含甘草酸單銨鹽對照品0.2 mg，折合甘草酸為0.195 9 mg)。

供試品溶液的制備:精密吸取0.1 g生藥/mL的甘草提取液1 mL，加水稀釋并定容至50 mL，搖勻，濾過，即得。

線性關系考察:精密吸取上述對照品溶液 1，2，4，6，8 mL，置10 mL量瓶中加流動相稀釋至刻度。按上述的色譜條件，分別進樣20 μL，測定其峰面積，并以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=15 974X+100.4，r2=0.999 7。結果表明，甘草酸在0.019 6～0.156 8 mg/mL的濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.1.2 甘草總皂苷含量測定方法(UV)

對照品溶液的制備:精密稱取甘草酸單銨鹽對照品10.1 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL用甲醇稀釋至10 mL，即得。

供試品溶液的制備:精密吸取樣品溶液1 mL，加甲醇稀釋并定容至50 mL，搖勻，濾過，即得。

最大吸收波長的確定:取對照品溶液，在紫外分光光度計上200～400 nm范圍內進行掃描。結果表明在258 nm處有最大吸收，故選用258 nm作為測定波長。

線性關系考察:精密量取對照品溶液(40.4 μg/mL)1，2，4，6，8 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，258 nm 測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程:Y=0.026 3X+0.013，r2=0.999 6，線性范圍:4.04 ～32.32 μg/mL。

2.2 甘草總皂苷的提取工藝

通過預實驗確定水為提取溶劑后，為優化水煎煮的條件，選用正交試驗法，選定加水量、煎煮時間、煎煮次數作為考察的3個因素，每個因素各取3個水平(見表1)。采用L9(34)正交進行試驗，以甘草酸和甘草總皂苷的提取率為考察指標，對結果進行方差分析，確定最佳提取工藝，見表2～4。

表1 因素水平表

表2 正交試驗

表3 方差分析(甘草酸)

表4 方差分析(總皂苷)

由正交試驗結果確定最佳提取工藝:加水量8倍，煎煮時間2 h，煎煮次數3次。按該提取工藝進行3次驗證試驗，結果甘草酸平均提取率為2.05%(RSD ＜2%)，甘草總皂苷平均提取率為4.2%(RSD ＜2%)。以最佳提取工藝提取，提取液加水定容到含生藥0.2 g/mL的溶液(甘草總皂苷含量為8.39 mg/mL)，作為下一步實驗上樣液。

甘草酸提取率=所測甘草酸量(g)/所用甘草量(g)×100%

甘草總皂苷提取率=所測總皂苷量(g)/所用甘草量(g)×100%

2.3 大孔樹脂純化工藝

2.3.1 樹脂型號篩選:精密稱取上述5種大孔樹脂(均相當于干樹脂1 g)，分裝入50 mL具塞錐形瓶中，精密加入上樣液50 mL(相當于0.2 g生藥/mL)，每30 min振搖1次，持續3 h后，靜置24 h，上樣液濾過，按2.1項下方法測定吸光度后，計算吸附量。濾出的各樹脂另置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，每30 min振搖1次，持續3 h，靜置24 h后濾過，測定吸光度，計算解吸率，結果見表5。綜合分析，HPD－300樹脂為甘草總皂苷純化的最佳樹脂。另取3份HPD－300樹脂(均相當于干樹脂1 g)，按上述方法進行3次平行實驗，結果平均比吸附量170.14 mg/g(RSD＜2%)，平均解吸率87.65%(RSD＜2%)，故選取 HPD－300樹脂為甘草總皂苷純化所用樹脂。

表5 大孔樹脂對甘草總皂苷的吸附及解吸的影響

比吸附量=(上樣液中總皂苷的質量濃度×體積－吸附后溶液中總皂苷的質量濃度×體積)/干樹脂質量

比洗脫量=洗脫液中總皂苷的質量/干樹脂質量

解吸率=(洗脫液質量濃度×體積)/飽和吸附量×100%

2.3.2 上樣液質量濃度的確定:準確稱取處理好的HPD－300型樹脂3份(均相當于干樹脂4 g)，濕法裝柱。取上樣液(生藥0.2 g/mL)50 mL，分別加水稀釋0、1、2倍，制備成質量濃度分別為0.2 g/mL、0.1 g/mL、0.05 g/mL的上樣液，每個質量濃度上樣液平行上柱，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV水沖洗，再換用4 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，得液體樣品。按2.1項下方法測定吸光度后，計算洗脫液中總皂苷比洗脫量，結果分別為75.6 mg/g、69.4 mg/g、67.5 mg/g。可見，在上柱液中總皂苷質量固定的情況下，上柱液質量濃度為0.2 g生藥/mL時洗脫效果最好。

2.3.3 最大上樣量的確定:準確稱取處理好的HPD－300樹脂裝柱(相當于干樹脂4 g)，精密吸取上樣液200 mL，以流速2 mL/min通過樹脂柱，每1BV接收一次流出液，并測定每份流出液中的總皂苷質量濃度，以流份份數與流出液中總皂苷質量濃度做圖，結果見圖1。可見在上樣液的質量濃度為0.2 g生藥/mL時，在第5個流份開始泄漏，因此確定最大上樣量為5BV。

2.3.4 洗脫劑體積分數的確定:精密吸取上樣液100 mL，以2 mL/min的流速連續通過HPD300樹脂柱，先用4 BV水沖洗，再依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，洗脫劑用量均為3 BV，每1 BV接收一次流出液，測定各段流出液中的總皂苷的質量濃度，結果見圖2。可見甘草總皂苷主要集中在50%～70%乙醇洗脫部分。

圖1 HPD300樹脂吸附總皂苷的動態吸附曲線

圖2 洗脫劑體積分數對動態洗脫性能的影晌

2.3.5 洗脫劑用量的確定:為進一步確定乙醇體積分數并考察洗脫劑用量，取100 mL上樣液分別上柱，均用水洗脫4 BV后，分別用50%和70%乙醇洗脫，控制流速2 mL/min，直至流出液無色，每1 BV接收一次流出液，測定各段流出液中的總皂苷的質量濃度，結果見圖3。可見50%乙醇洗脫效果好于70%乙醇，且在第6份洗脫液中總皂苷已經很少，可認為樹脂柱上吸附的總皂苷已經洗脫完全，故確定洗脫劑為50%乙醇，用量為6 BV。

圖3 不同體積分數乙醇的洗脫曲線

3 討論

本實驗采用正交試驗確定了甘草總皂苷的水煎煮提取條件為加水量8倍，煎煮時間2 h，煎煮次數3次。在這種條件下，甘草總皂苷提取率能達到4.2%。

實驗表明HPD300型大孔吸附樹脂對甘草總皂苷具有良好的吸附性能，具有較大的吸附量，且易吸附、易解吸。其工藝條件為上樣液質量濃度為0.2 g生藥/mL，上樣量5 BV;50%乙醇洗脫6 BV。

實驗中確定的總皂苷提取純化工藝可為進一步提取純化甘草總皂苷提供借鑒，從而為進一步開發甘草有效部位新藥提供參考。

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