小飛蓬總黃酮提取工藝優選及體外抗氧化活性研究

趙 爽， 嚴銘銘， 趙大慶， 黃耀玲， 唐 燦

(長春中醫藥大學，吉林長春 130117)

小飛蓬Erigeron canadensisL.為菊科植物小飛蓬Erigeron canadensisL.的干燥全草［1］。有文獻記載小飛蓬的藥用有清熱利濕、散瘀消腫、改善腎的微循環的功效［2］并且還具有較強抗腫瘤的藥理作用［2］。本課題組已從該中藥材中分離出近二十余種黃酮類化合物，主要為:蘆丁、槲皮素、木犀草素、芹菜素、5，7，4′－三羥基－3′－甲氧基黃酮、圣草酚、4′－羥基黃芩素－7－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、4′－羥基黃芩素－7－O－β－D－吡喃葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物［3］。在進一步對小飛蓬總黃酮提取物進行研究發現，小飛蓬黃酮類化合物除了具有文獻報道的藥理作用以外，還具有較強的抗氧化活性，在抗老化，抗突變，調血脂等方面具有一定的臨床應用價值。

本試驗以優選小飛蓬總黃酮最佳乙醇提取工藝為目標，采用正交實驗法，以總黃酮和槲皮素的含量為指標對乙醇提取工藝進行比較，確立了最佳提取工藝，并對其體外自由基的清除作用進行了初步研究，為小飛蓬的利用和綜合開發提供參考。

1 實驗材料

UV－1700型分光光度計(日本島津公司);Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);METTLER－AE240型電子分析天平(瑞士METTLER公司);BUCHI旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)。

蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，編號:111520－200201)、槲皮素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，編號0721－200010)，二者純度都達到98%以上，供含量測定用。1，1 二苯基苦味苯肼(1.1－dipbenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)、維生素C(Vit C)對照品、維生素E(Vit E)對照品均購于sigma公司;大孔吸附樹脂(天津南開大學化工廠);色譜級甲醇購于美國Fisher公司，其余試劑均為分析純，均購于(北京精細化學品有限責任公司)。

小飛蓬采于吉林省長白縣，經長春中醫藥大學姜大成教授鑒定為菊科飛蓬屬植物小飛蓬Erigeron canadensisL.。

2 實驗方法

2.1 總黃酮含量測定方法［4］

2.1.1 對照品溶液的制備:精密稱取5.38 mg蘆丁對照品于25 mL量瓶，70%乙醇溶解并定容，配制成濃度為0.209 mg/mL的蘆丁標準溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制:分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL蘆丁對照品溶液于10 mL量瓶中，加70%乙醇至5 mL，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，之后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，最后用70%乙醇稀釋定容，搖勻，放置15 min，進行全波長掃描，結果均在510 nm處有最大吸收峰。在510 nm處測定不同濃度下的吸光度值作標準曲線。得蘆丁濃度Y與吸光度A關系曲線回歸方程式:Y=11.604X－0.011 3，相關系數:r=0.999 5，表明蘆丁在0.010 8～0.064 6 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線形關系。

2.1.3 樣品溶液的制備:分別稱取小飛蓬粗粉500 g按表4正交實驗表中的條件進行乙醇回流提取，合并濾液，過濾，濾液蒸干，即得小飛蓬總黃酮提取物。精密稱取上述按正交表制備的相應總黃酮提取物50 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加70%乙醇定容至5 mL，照2.1.2項下自加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL起，在510 nm下測定其吸光度，帶入標準曲線計算其總黃酮濃度。

2.2 槲皮素含量測定方法［5］

2.2.1 色譜條件:色譜柱:Agilent Zorbax SB－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇 －0.5%磷酸(47 ∶53)，流速:1.0 mL/min;檢測波長為360 nm;柱溫:30℃;理論塔板數按槲皮素計應不低于4 000。

2.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取槲皮素對照品溶液6.5 mg置100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.065 mg/mL的槲皮素對照品溶液。

2.2.3 標準曲線的繪制:精密吸取上述對照品溶液8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0 μL 注入高效液相色譜儀中。按照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品的進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得槲皮素的標準曲線為:Y=1 081X+16.062，r=0.999 9。表明槲皮素進樣量在0.52～1.17 μg范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.2.4 樣品溶液的制備:稱取上述按正交表制備的相應總黃酮提取物5 g，加乙酸乙酯回流提取3次，每次500 mL，合并3次乙酸乙酯提取液，減壓蒸餾回收，提取物蒸干，加甲醇30 mL溶解，拌樣于5 g聚酰胺(100～200目)，收集95%乙醇洗脫液，60℃水浴蒸干，加甲醇10 mL，超聲，過濾，濾液蒸干，加甲醇溶解，轉至10 mL量瓶中，甲醇定容，經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。分別精密稱取對照品溶液與樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定槲皮素含量。

2.3 DPPH溶液的配制及測定方法

在裝有2 mL濃度為132.0 μg/mL的DPPH70%乙醇溶液的比色管中，加入不同濃度的樣品溶液2 mL搖勻，避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度Ai。用70%乙醇溶液代替樣品溶液，得吸光度A0。70%乙醇代替DPPH，得吸光度Aj詳見文獻［6］。

清除率=1－［(Ai－Aj)/A0］×100%

式中，A0為2 mL DPPH70%乙醇溶液和2 mL70%乙醇溶液的吸光度;Ai為2 mL的DPPH70%乙醇溶液和2 mL樣品的吸光度;Aj為2 mL70%乙醇溶液和2 mL樣品的吸光度。

3 結果與分析

3.1 單因素對提取率的影響研究

3.1.1 提取次數的影響 分別稱取小飛蓬500 g，設定提取4次，每次提取1.0 h，料液比1∶10，70%乙醇加熱回流提取。計算每次提取總黃酮含量在4次總黃酮含量總和中所占的比例。結果見表1。

從表1中可以看出第1次提取總黃酮含量占總含量53%，達到了總體含量一半以上，第2次提取總黃酮含量達到42%占總黃酮含量很高的比例，第3次提取和第4次提取總黃酮含量只達到4%和1%占總黃酮總量很小比例，為了考慮節約成本，提高效率，則取消第3次和第4次提取次數。

表1 提取次數對總黃酮含量的影響(n=2)

3.1.2 提取時間的影響 提取時間過短，有效成分提取不完全，提取時間過長，費時且成本較高。根據實驗預試并參照文獻報道，提取時間選擇1.0 h、1.5 h、2.0 h提取效果較好。

3.1.3 料液比的影響 加醇量太少，不能完全浸沒藥材，有效成分提取不完全，加醇量太大，成本較高。根據預試結果，加醇量為8倍、10倍、12倍較為合理。

3.1.4 醇濃度的影響 由于小飛蓬除了含有脂溶性成分外，且含有水溶性成分，為了將有效成分提取完全，以蘆丁含量為指標，選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，對醇提濃度進行了優選預示試驗，結果見表2，從表2中可以看出，當乙醇濃為70%時小飛蓬總黃酮的含量較高，故得出醇提濃度最佳范圍為65%～75%。

表2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響(n=2)

3.2 小飛蓬有效部位提取工藝的優化

單因素實驗說明，提取次數為2次時，提取的小飛蓬總黃酮的量已達到其總量的95%以上，為適合工業化生產，節省能源，選取提取次數為2次，在此基礎上，對乙醇濃度、提取時間及料液比進行進一步的優選，采用L9(34)正交試驗表進行實驗，因素水平見表3，正交試驗結果見表4、表5。

表3 因素水平表

以小飛蓬總黃酮含量為考察指標時，方差分析表明:因素C和因素A對總黃酮的影響最大，因素B對結果有影響，直觀分析表明:最佳提取工藝為A2B1C2;以槲皮素含量為考察指標時，方差分析表明:因素B對槲皮素提取的影響最大，因素A對其有影響，而因素C對結果無影響，直觀分析表明:最佳提取工藝為A2B1C3。綜合上述兩個考察指標的方差及直觀分析，可以看出因素A與B優選的結果一致，因素C對總黃酮提取影響較大，而對槲皮素提取無影響，為有效地將總黃酮提取出來，制定A2B1C2作為最佳提取方案，即70%乙醇、料液比1∶10、每次1.0 h。

3.3 驗證實驗

稱取小飛蓬藥材3批，按正交實驗優選結果進行提取并測定其含量。結果見表6。

3.4 體外抗氧化實驗

DPPH自由基清除 DPPH自由基是判定藥物體外抗氧化活性的經典實驗方法，并利用維生素E能抑制脂溶性抗氧化物和維生素C能抑制水溶性抗氧化物的特點綜合評定小飛蓬總黃酮的抗氧化活性。以正交優選工藝制備的小飛蓬總黃酮樣品A及在此優選工藝上進一步純化的小飛蓬總黃酮精制品B及精制品C進行了自由基的清除能力實驗，并與相應濃度的維生素C和維生素E作為對照，結果見表7。

表4正交試驗設計結果(n=2)

表5正交實驗方差分析

表6 正交工藝驗證實驗

表7 各供試品IC50值(n=2)

由表7可知，不同總黃酮含量的樣品清除DPPH自由基的能力存在顯著性差異，其中優選工藝樣品A逐步純化得到樣品B活性強于維生素E而弱于維生素C，最終純化樣品C的活性高于維生素E及維生素C。證明樣品A和B對脂溶性自由基有很強的抗氧化活性，樣品C由于進一步進行純化，隨著含量的不斷提高不但對脂溶性自由基抗氧化活性逐步增強并且對水溶性自由基抗氧化活性也明顯增強。

4 結論

4.1 本實驗在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗法對小飛蓬中總黃酮有效部位的乙醇提取工藝進行了優選，選用L9(34)正交進行考察，實驗結果表明小飛蓬有效部位最佳提取工藝條件是，以70%乙醇為提取溶劑，在1∶10料液比條件下提取2次每次1.0 h。該提取工藝簡單，條件易于控制，提取率高。

4.2 抗氧化實驗表明，黃酮類成分清除DPPH自由基的能力與化合物中酚羥基的取代個數和位置有關;中藥清除DPPH自由基能力與總黃酮類成分含量之間存在相關性。小飛蓬中的黃酮類化合物有良好的DPPH清除活性，且隨著小飛蓬中總黃酮含量的提高，IC50值也明顯提高，即隨著小飛蓬中總黃酮含量的提高，其抗氧化活性明顯增強。

［1］林 容，陳藝林.中國植物志，菊科(一)［M］.第74卷.北京:科學出版社，1985:295.

［2］劉大奎.燈盞花素治療糖尿病腎病高粘血癥療效觀察［J］.湖北中醫雜志，2003，25(5):13－14.

［3］邵 帥，嚴銘銘，畢勝男，等.小飛蓬化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，2009，44(14):1053－1055.

［4］張縱圓，彭 秧，索金玲，等.葡萄葉中總黃酮的提取工藝優化及體外抗氧化作用研究［J］.中成藥，2009，31(2):292－294.

［5］溫梅云，鐘 球，鐘 鳴.HPLC法測定通淋顆粒中槲皮素和山奈素的含量［J］.國際醫藥衛生導報，2007，13(4):86－88.

［6］Blois M S.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，1958，181:1199－1200.