高效液相色譜法同時測定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量

黃興富， 黎其萬， 劉宏程， 王繼良， 孫浩巖， 邵金良

(1.云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所，云南 昆明 650223;2.昆明醫學院藥學院，云南 昆明 650031)

苦蕎麥Fagopyrum tataricum又名韃靼蕎麥，是適于在寒冷氣候下生長的寥科蕎麥屬一年生草本雙子葉植物，其根、莖、葉、花、種子及籽殼中都含有大量黃酮類化合物，主要成分有槲皮素、山柰酚和蘆丁等［1］。傳統醫學和現代醫學都證實苦蕎具有降血糖、降血脂、降尿糖、防便秘等功效［2-3］。被權威專家稱為“三降食品”和“21世紀人類的健康食品”。此外，苦蕎中蛋白質含量也較高，有極高的營養和醫藥價值［4］。蕎麥蛋白除能顯著降低血液膽固醇濃度，其效果優于大豆蛋白質［5］，還具有抗衰老、抑制大腸癌的發生等作用。目前國內對植物中的黃酮類化合物的測定主要有比色法，紫外分光光度法和HPLC法［6］，但比色法的干擾因素較多，而紫外分光光度法準確度不高。近年來國內有采用高效液相色譜法測定苦蕎黃酮中蘆丁、金絲桃苷、牡荊苷、槲皮素等黃酮化合物的含量［7-8］，但尚未見文獻報道同時測定蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量。本試驗建立了用高效液相色譜同時測定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚含量的方法，并對用90%甲醇索氏提取物蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安Summit高效液相色譜儀;電子分析天平(德國賽多利斯CP-224S，0.1 mg/100 g)。

1.2 試藥 蘆丁(含量≥98%，批號:100080-200707)、槲皮素(含量≥98%，批號:100081-200406)和山柰酚(含量≥98%，批號:0861-200002)對照品均購于中國藥品生物制品檢定所;17種不同品種的蕎麥(云南省農科院生物與種資資源研究所提供);乙腈為色譜純(Tedia，美國)，流動相用水為去離子水經0.45 μm膜過濾;甲醇和磷酸均為分析純。

2 溶液的配制

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品蘆丁10 mg、槲皮素1 mg和山柰酚1 mg，于10 mL量瓶中，用甲醇定容，配成濃度分別為1，0.1和0.1 mg/mL的對照品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取樣品 10.0 g，用90%甲醇索氏提取，旋轉蒸發濃縮，于100 mL量瓶中，加甲醇定容，取1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。

3 色譜條件

色譜柱:Diamonsil-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動相組成:乙腈-0.2%磷酸溶液線性梯度洗脫，洗脫程序見表1;流速:1.0 mL/min;檢測波長:365 nm;進樣量:20 μL。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)的色譜圖

4 方法與結果

4.1 線性關系考察 精密吸取蘆丁、槲皮素和山柰酚對照品貯備液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL;0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL;0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，于 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度的對照品混合溶液，取20 μL進樣后記錄峰面識，以峰面積Y對對照品濃度X繪制標準曲線。得到蘆丁、槲皮素和山柰酚的回歸方程分別為:

蘆丁、槲皮素和山柰酚的線性范圍分別為:40～200 μg/mL、2 ～16 μg/mL、1 ～12 μg/mL。液相色譜的信噪比 S/N=3。蘆丁、槲皮素和山柰酚的最低檢測限分別為0.03 μg/mL、0.009 μg/mL、0.005 μg/mL。

4.2 精密度試驗 精密稱取6份樣品(西苦6-14)10.0 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算蘆丁、槲皮素和山柰酚的RSD分別為0.84%、0.57%、1.27%。

4.3 穩定性試驗 精密吸取蘆丁、槲皮素和山柰酚的對照品溶液，配成濃度分別為120、8、4 μg/mL在室溫下放置，分別在 0、2、4、8、12、24 h 時測定，計算得蘆丁、槲皮素和山柰酚峰面積RSD分別為0.78%、0.83%、1.34%。表明對照品溶液在24 h內穩定。

4.4 重復性試驗 分別精密稱取樣品(西苦6-14)6份，按2.2項下的供試品溶液制備方法制備，進樣20 μL，記錄峰面積，測得樣品中蘆丁、槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為0.77%、0.51%和1.18%。

4.5 加樣回收率試驗 精密稱取樣品(西苦6-14)11份，每份約10.0 g，樣品按2.2項處理。1份是空白，其余10份分為2組，分別精密加入約相當于樣品中蘆丁、槲皮素和山柰酚含量80%、120%的對照品(各5個)，按供試品溶液制備和測定方法操作，計算蘆丁、槲皮素和山柰酚的平均回收率分別為:97.86%、99.02%、97.85%。見表2。

4.6 樣品含量測定 分別精密稱取每個品種的苦蕎3份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件和測定方法，測定峰面積，外標法計算，結果每個品種的苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量分別見表3。

5 討論

5.1 波長的選擇 本試驗考擦了260 nm和365 nm不同吸收波長的圖譜，發現蘆丁、槲皮素和山柰酚的最大吸收波長不一，在365 nm波長下槲皮素和山柰酚有最大吸收，而蘆丁也有較好的吸收，且干擾少，圖譜特征性強。故選擇365 nm為檢測波長。

5.2 流動相的選擇 在實驗過程中曾試過甲醇-水，乙腈-水溶液等為流動相，分離效果均不理想，色譜峰拖尾嚴重，而采用乙腈-0.2%磷酸水溶液后分離效果有明顯的改善，且峰形均較好，無拖尾現象，故最后選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相。

5.3 提取方法的選擇 對苦蕎的提取方法做了下列考察(溶劑為甲醇和乙醇):索氏提取法、浸漬法、回流提取法、超聲波提取法，發現用索氏提取法，溶劑為甲醇的效果最好。又對60%、80%、90%和100%的甲醇做了考擦，結果發現90%的甲醇提取的黃酮是最多的，尤其是山柰酚。

表2加樣回收率試驗(n=5)

表3 不同來源苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量(n=3)

5.4 樣品測定結果分析 從測定結果看，10個不同來源苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量存在較大的差異:云蕎53中蘆丁的含量最高，KQ08-10中蘆丁的含量最少;KQ08-10中槲皮素的含量最高，四川西昌苦3-7中槲皮素的含量最少;KQ08-06中山柰酚的含量最高，四川梁山苦和云蕎63中都沒檢測到山柰酚。

這為尋找苦蕎同時具有高含量蘆丁、槲皮素和山柰酚等黃酮化合物提供了可能，為以后品質性狀的選擇或雜交選育提供了依據。

5.5 小結 本試驗采用 HPLC法同時測定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚3種成分的含量，方法簡便快速，結果準確，可用于苦蕎的質量控制。

［1］Zhang Zheng，Zhou Yuan，Wang Zhuanhua，et al.Study of antioxidang activity of flavonoid in tartary buckwheat［J］.Pharm Biotechnol，2001 ，8(4):217-220.

［2］Ren W，Qiao Z，Wang H，et al.Tartary buckwheat flavoniod activatea caspase 3 and induces HL-60 cell apoptosis［J］.MethodsFind Exp Clin Pharmacol，2001，23(8):427-432.

［3］劉淑梅，韓淑英，霍國金，等.甜蕎麥葉總黃酮降糖降脂作用及機制［J］.第四軍醫大學學報，2003，22(19):1815-1817.

［4］祁學忠，吉鎖興，王曉燕，等.苦蕎黃酮及其降血糖作用的研究［J］.科技情報開發與經濟，2003，13(8):111-112.

［5］李 丹，丁霄霖.苦蕎黃酮抗氧化作用的研究.食品科學，2001，22(4):22-23.

［6］林汝法，周小理，任貴興.中國蕎麥的生產與貿易、營養與食品［J］.食品科學，2005，26(1):259-263.

［7］Kayashita J，Shimaoka I，Nakajioh M.Production of buckwheat protein extract and its hypoholesterlemic Effect［G］//.Current Advances in Buckwheat Research，1995:919-926.

［8］莊向平，虞杏英.銀杏葉中黃酮含量的測定和提取方法［J］.中草藥，1992，23(3):122-124.

［9］張鶴鳴，王寧生.銀杏提取物及其制劑中黃酮苷類的質量控制方法評述［J］.廣東藥學院學報，2001，17(2):127-129.

［10］徐寶才，李 丹，丁霄霖.蕎麥黃酮的提取、測定及其抗氧化研究進展［J］.中草藥，2001，(增):189-191.

［11］衛星星，王轉花.高效液相色譜法測定苦蕎籽殼中蘆丁和槲皮素的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(12):1909-1910.

［12］徐寶才，肖 剛，丁霄霖.液質聯用分析測定苦蕎黃酮［J］.食品科學，2003，12(6):113-117.