HPLC同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子中沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯的含量

秦冬梅， 胡利萍， 張躍新

(1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832002;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，新疆烏魯木齊830054)

沒(méi)食子(Turkish galls)為殼斗科植物沒(méi)食子樹(shù)Quercus infectoria Oliv幼枝上的干燥蟲(chóng)癭，由沒(méi)食子蜂科昆蟲(chóng)沒(méi)食子蜂Cynips gallae-tinctoriae Oliv.幼蟲(chóng)寄生而形成。沒(méi)食子是維吾爾醫(yī)常用藥，沒(méi)食子中含有大量的可水解鞣質(zhì)，具有固澀、收斂、燥濕、止血、消炎的作用［1］。沒(méi)食子鞣質(zhì)多數(shù)為無(wú)定形粉末，并且具有較多的鄰位酚羥基，易被氧化，因此，很難獲得單體。從沒(méi)食子鞣質(zhì)中分離得到了單體鞣質(zhì)沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯，故制訂了高效液相法同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子酸與食子酸甲酯的含量，以控制藥品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試藥

Waters液相色譜儀;DK-S26型電熱恒溫［水浴鍋(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);單盤(pán)光電分析天平(北京光學(xué)儀器廠，d:0.01 mg);實(shí)驗(yàn)用植物購(gòu)于新疆參茸藥業(yè)有限公司，品種鑒定由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院中藥系完成，沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):831-9501);沒(méi)食子酸甲酯對(duì)照品(自制)，經(jīng)鑒定純度達(dá)99.42%，其 H-NMR、13C-NMR、UV、IR和ESI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［2］對(duì)照一致。甲醇為色譜純，水為重蒸水，磷酸(分析純)，甲醇(分析純)。

1.2 色譜條件［3］色譜柱:

YMC ODS-A C18柱(250 mm ×4.6 mm，S-5 μm，12 nm);檢測(cè)波長(zhǎng):273 nm;流動(dòng)相:乙腈-0.5%磷酸溶液(21∶79);流速:0.50 mL/min;柱溫:25℃。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸甲酯峰計(jì)算為2 100，外標(biāo)法。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，用甲醇定容制成含沒(méi)食子酸0.050 mg/mL，精密稱取沒(méi)食子酸甲酯對(duì)照品適量，用甲醇定容制成含沒(méi)食子酸甲酯0.130 0 mg/mL的溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制［4］取本品研細(xì)，精密稱取適量(約1 g)，置于棕色具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，超聲提取30 min，放冷致室溫，過(guò)微孔濾膜(0.45 μm)，即得。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、樣品溶液注入色譜儀，按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，1號(hào)峰為沒(méi)食子酸，2號(hào)峰為沒(méi)食子酸甲酯，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取濃度為0.050 0 mg/mL沒(méi)食子酸與0.130 0 mg/mL的沒(méi)食子酸甲酯對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量分別為0.5、2、5、8、10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積積分值(A)對(duì)進(jìn)樣量(μg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯分別得回歸方程y=3 697 526x-9 965 r=0.999 6;y=4 434 792x-14 628 r=0.999 2，沒(méi)食子酸在0.050 6～0.406 0 μg范圍內(nèi)峰面積值(y)對(duì)進(jìn)樣量(x)有良好線性關(guān)系，沒(méi)食子酸甲酯在0.116～1.044 μg范圍內(nèi)，峰面積值(y)對(duì)進(jìn)樣量(x)有良好線性關(guān)系。

圖1 對(duì)照品(A)、供試品(B)色譜圖

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下，按1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算含量的RSD分別為0.84%，1.05%;供試液分別連續(xù)5d測(cè)定沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯含量，計(jì)算含量的RSD分為0.95%，1.08%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液10 μL，分別在 0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，試驗(yàn)結(jié)果表明樣品溶液在 10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯的 RSD分別為1.09%，1.62%。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批樣品，6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)峰面積，并計(jì)算沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯含量。沒(méi)食子酸平均含量為9.52 mg/mL，RSD為0.96%，沒(méi)食子酸甲酯平均含量為2.76 mg/mL，RSD為0.71%。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收法。分別稱取已知含量的供試品9份，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法精密加入對(duì)照品溶液，制備高、中、低3個(gè)濃度的溶液，依條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各組分的回收率。沒(méi)食子酸的平均回收率為98.8%，RSD為1.50%，沒(méi)食子酸甲酯的平均回收率為98.50%，RSD為1.26%。見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

按2.1.2項(xiàng)下處理方法配置，依上述方法分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 以流動(dòng)相作溶劑，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定了沒(méi)食子酸紫外光譜圖，結(jié)果在273 nm處有最大吸收，確定273 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了沒(méi)食子酸在甲醇與水中的穩(wěn)定性［5-7］，結(jié)果沒(méi)食子酸甲酯在甲醇中8h內(nèi)穩(wěn)定，在水中不穩(wěn)定，故選用甲醇為溶劑。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.3 提取方式以及提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)中考察了不同提取方式(加熱回流和超聲提取)、不同提取時(shí)間(30、45、60 min)。結(jié)果表明，精密加入甲醇25 mL超聲處理30 min，可將樣品中的沒(méi)食子酸提取完全［8-10］。

3.4 建立了測(cè)定沒(méi)食子中沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯的高效液相色譜法，該方法可作為測(cè)定藥材和制劑中沒(méi)食子酸與沒(méi)食子酸甲酯含量的方法［9-10］，可作為其質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

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