泛素-蛋白酶體系統與帕金森病

張 穎 高 鵬 許 穎 金 濤 (吉林大學第一醫院神經內科，吉林 長春 300)

目前帕金森病(PD)的病因和發病機制尚不完全清楚，可能是遺傳和環境因素相互作用的結果。泛素-蛋白酶體系統(UPS)在許多與細胞周期性增殖和凋亡相關的蛋白質的降解中起重要作用。UPS可清除真核細胞內突變、損傷及異常折疊的蛋白質，起到調控蛋白質和維持細胞內環境穩定的作用。在一些家族性PD中發現α-synuclein、parkin和UCH-L1發生基因突變，突變后的三種蛋白質與UPS的功能損害密切相關。尸檢研究表明在散發PD患者的黑質中也存在UPS功能的降低。這提示UPS功能受損可能是不同病因作用的共同途徑。本文就UPS與PD間關系的研究進展做一綜述。

1 泛素-蛋白酶體系統與蛋白質的降解

許多有害蛋白質的降解過程是以蛋白質與泛素分子鏈的結合開始的，蛋白質與泛素分子結合是被蛋白酶體識別和降解的標志。靶蛋白的多聚泛素化過程是由一系列酶所介導的〔1〕。首先，泛素單體在ATP依賴的反應中由泛素活化酶(E1)激活。激活的泛素被傳遞給一種泛素耦聯酶(E2)，然后通過ATP依賴的反應由一種泛素蛋白連接酶(E3)催化共價連接到靶蛋白上。上述反應重復進行，持續地將泛素分子加到靶蛋白上導致多聚泛素鏈的形成。多聚泛素化的蛋白質由26S蛋白酶體識別并降解。

蛋白酶體是在胞漿、內質網、核周區域及真核細胞的細胞核中發現的具有多催化作用的蛋白酶〔2〕。26S蛋白酶體由一個蛋白水解酶核心(20S蛋白酶體)及其調節亞單位(PA700)組成。20S蛋白酶體是由28個亞單位組成的四個環狀結構軸向堆積而成的一個中空的圓柱狀結構，可在其內部發生蛋白水解。PA700是26S蛋白酶體主要的調節亞單位，PA700至少含有6種ATP酶，執行至少3種ATP依賴性功能。PA700和20S蛋白酶體的結合利于蛋白質的進入，并為蛋白降解提供能量。26S蛋白酶體介導的水解終產物是小肽片段，這些小肽片段再由其它的蛋白酶進一步處理，產生它們的組成氨基酸。

在多聚泛素化的蛋白質進入蛋白酶體核心之前，泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)將多聚泛素鏈與靶蛋白拆開并分解泛素鏈以生成自由的單體泛素分子，后者再進入泛素循環〔1〕。由此可見，蛋白質的泛素化是泛素與泛素酶共同作用的動態過程。UPS的功能缺陷將導致蛋白質的異常積聚，導致細胞內不溶性包涵體的形成及細胞平衡和完整性的破壞。此外，蛋白質的積聚能導致Jun激酶和細胞凋亡的上調〔3〕。

2 泛素-蛋白酶體系統與遺傳性帕金森病

2.1 Parkin突變與PD Parkin蛋白由465個氨基酸組成，其編碼基因的各種缺失、刪減及點突變可引起常染色體隱性遺傳性少年型帕金森病(AR-JP)。

Parkin具有泛素蛋白連接酶E3的功能。在AR-JP患者腦中發現變性腦區和未受影響腦區parkin的水平和酶活性降低甚至缺乏〔4〕。Parkin突變導致不能清除其底物蛋白質，而正常情況下底物蛋白質可被parkin泛素化然后被蛋白酶體降解。在細胞系中表達突變的parkin可導致蛋白酶體活性降低、氧化應激水平增加及自由基介導的蛋白質和脂質的損害〔5〕。因此，parkin突變通過阻止底物蛋白質的正常泛素化及經蛋白酶體的降解，最終導致正常細胞功能的破壞和疾病的發生。

2.2 UCH-L1突變與PD UCH-L1異常的常染色體顯性遺傳性PD首先在一對兄弟間發現，遺傳分析顯示編碼UCH-L1的基因發生錯譯突變，導致蛋白質內93位的異亮氨酸由蛋氨酸替代。UCH-L1屬于去泛素酶家族，約占腦組織蛋白質總含量的1%，其功能主要是參與單體泛素分子的再循環〔6〕。UCH-L1突變病人腦中是否存在UCH-L1活性及表達的改變目前還不清楚。在大腸桿菌中表達突變的UCH-L1，結果顯示這種酶的活性下降50%〔7〕。最近的一項研究發現，在大鼠中腦腹側細胞的培養中用泛素乙醛阻斷UCH-L1作用，可導致多巴胺能神經元出現劑量依賴性的變性并伴有泛素水平的降低及α-synuclein陽性包涵體的形成〔8〕。因此PD病人UCH-L1的突變可能導致酶活性的喪失，減少泛素自由單體的供應，不能正常標記底物蛋白質，從而影響蛋白質的清除，引起黑質病理改變。

2.3 α-synuclein突變與PD α-synuclein是Lewy小體中的主要組分。其基因的點突變A53T和A30P引起常染色體顯性遺傳性PD。α-synuclein的正常功能尚不完全清楚，推測與突觸功能，例如突觸可塑性及多巴胺能神經遞質的傳遞有關。最近的研究提示α-synuclein還與多巴胺的生物合成有關〔9〕。也有證據提示α-synuclein能發揮分子伴侶的作用，參與異常蛋白質的再折疊及促進異常蛋白質進入蛋白酶體并在那里降解〔10〕。

在多巴胺能神經元和其他培養細胞表達突變的α-synuclein，能誘導神經元變性及α-synuclein和泛素陽性包含體形成，并且引起蛋白酶體活性的降低〔11〕。過表達野生型和突變型αsynuclein的果蠅出現多巴胺能神經元喪失和Lewy小體樣包含體形成，共表達HSP70可以減輕這種異常，而干擾HSP70的活性則能加重α-synuclein介導的毒性〔12〕。然而，在轉基因嚙齒類動物方面的研究卻出現有爭議的結果。一些研究發現轉A53T基因鼠在成年出現黑質－紋狀體變性、α-synuclein及泛素陽性包含體形成和運動障礙。然而也有其他的報道稱該種模型只有紋狀體神經纖維喪失而無黑質多巴胺能神經元變性，也沒有黑質包含體形成及運動障礙。這些研究結果的差異可能與實驗方法及動物品種不同有關。

α-synuclein突變引起多巴胺能神經元死亡的生化機制可能涉及它對UPS清除的抵抗及蛋白酶體的損壞〔13〕。突變及損傷的蛋白質被認為可以飽和并抑制UPS的活性，導致大量的未能被充分降解的蛋白質在細胞內聚集。野生型α-synuclein可由蛋白酶體降解，但是突變的α-synuclein相對地抵抗蛋白水解。此外，在PC12細胞，突變型的α-synuclein還可抑制UPS的活性，導致不能被充分降解的泛素化蛋白質的進一步聚集、包含體的形成及細胞死亡。同時，表達突變的α-synuclein后，培養的細胞對蛋白酶體抑制劑及氧化應激更加敏感，進一步提示它對UPS活性的干預。事實上，α-synuclein可直接與PA700相互作用，直接抑制蛋白酶體活性。因此，UPS清除突變的αsynuclein的功能衰竭能夠解釋一部分家族PD病人α-synuclein及其他蛋白質在Lewy小體內的聚集、細胞功能的改變及神經變性。

3 泛素－蛋白酶體系統與散發性帕金森病

逐漸增加的證據提示，蛋白水解應激構成散發PD神經變性及Lewy小體形成的基礎。在黑質氧化蛋白質的聚集提示在這一腦區蛋白質的清除是不充分的。也有在黑質蛋白質沉積增加的證據，更提示了蛋白質在該區域的聚集。推測這種蛋白水解應激及蛋白質聚集可能與散發PD黑質26/20S蛋白酶體結構及功能的缺陷有關。

對散發PD患者尸檢標本的研究發現，黑質中存在蛋白酶體活性的選擇性損害及蛋白酶體亞單位表達的降低〔14〕。事實上，在散發PD患者黑質20S/26S蛋白酶體三種酶活性的每一種都大約有40%被抑制，而皮層及紋狀體則沒有這種改變。同樣，在散發PD黑質多巴胺能神經元內20S蛋白酶體的α亞單位而不是β亞單位顯著缺失，而在其他腦區和在年齡匹配的對照組卻沒有觀察到這種現象。α亞單位的丟失可引起26/20S蛋白酶復合體的不穩定性、蛋白酶體裝配的缺陷及PA700與20S蛋白酶體結合能力的降低，這些變化均能導致蛋白酶體功能活性的損害。此外，與其他腦區比較，散發PD黑質中PA700的表達水平顯著降低，而PA28的表達水平更是非常顯著地降低，幾乎檢測不到。總之，以上研究均提示UPS功能紊亂可能是構成散發PD黑質多巴胺能神經元易感及變性的基礎。

4 泛素－蛋白酶體系統與帕金森病模型

如上所述，PD病人確實存在UPS功能的損害。然而，還不知道UPS功能的損害是神經變性的原發性還是繼發性因素。

在大鼠應用線粒體復合體Ⅰ抑制劑魚藤酮，可選擇性地誘導黑質－紋狀體通路多巴胺能神經變性及富含α-synuclein的胞漿包含體形成，因而可模擬PD的病理特征〔15〕。為了理解UPS和PD發病機制間的關系，在應用魚藤酮的大鼠檢驗大腦皮層、紋狀體及中腦蛋白酶體的功能，發現腹側中腦20S蛋白酶體的酶活性顯著地和選擇性地降低。此外，腹側中腦中被泛素標記的蛋白質(蛋白質降解的指示劑)的水平也顯著增加，這進一步提示26S蛋白酶體降解通路的損害〔16〕。蛋白酶體功能的損害可能由復合體Ⅰ抑制誘導的能量產生障礙(如ATP的產生)引起，或者由復合體Ⅰ抑制誘導的自由基形成增加所致。應用腹側中腦原代細胞培養的研究提示，魚藤酮誘導的蛋白酶體功能損害主要由于ATP的耗竭而非自由基的產生。然而，慢性暴露于低水平的魚藤酮極少引起生物能量變化，但可顯著增加氧化應激的水平，提示增加的氧化應激可能對神經元變性起更大的作用。在魚藤酮處理后觀察到氧化損傷蛋白質水平的增加，這可以通過阻礙UPS或者通過直接氧化修飾蛋白酶體自身的亞單位損害蛋白酶體通路。研究顯示〔17〕，在SH-SY5Y成神經瘤細胞，魚藤酮對復合體Ⅰ的抑制通過增加氧化修飾蛋白質產物來降低蛋白酶體的活性，這也包括蛋白酶體自身的氧化修飾。因此，增加的氧化應激可抑制蛋白酶體的功能并最終導致神經元變性。

最新的實驗表明，給成年大鼠系統地注射天然的(epoxomicin)或人工合成的(PSI)蛋白酶體抑制劑，經過1～2 w的潛伏期，動物出現進展型的帕金森綜合征，表現為運動徐緩、僵直、震顫及姿勢異常，經阿樸嗎啡治療上述癥狀可明顯改善〔18〕。正電子發射x線斷層攝影證實，C11標記的CFT與紋狀體多巴胺能神經末梢的結合降低，提示黑質－紋狀體路徑的變性。尸檢分析顯示紋狀體多巴胺的損耗及黑質致密部伴有凋亡及炎癥的多巴胺能細胞死亡。另外，神經變性也發生在藍斑、迷走神經背側運動核及Meynert基底核。在神經變性部位，部分殘存的神經元可見胞漿內嗜曙紅的、含有α-synuclein/泛素的、類似Lewy小體的包涵體。蛋白酶體抑制劑所誘導的動物模型很好地模擬了PD的病理特征，為研究PD發病機制及藥物治療提供了新的有價值的模型。

5 泛素－蛋白酶體系統與氧化應激

PD與氧化應激及線粒體功能紊亂密切相關。氧化應激狀態可來自于:①有高度活性的自由基產物增加;②清除這些活性基團的能力降低;③氧化損傷的蛋白質、脂質及DNA產生的增加，及③對細胞有毒性作用的氧化產物清除的降低。許多細胞過程可以形成自由基，包括線粒體氧化呼吸鏈及多巴胺代謝。在線粒體電子傳遞鏈的某些位點存在電子泄漏。與PD相關的電子泄漏位點存在于電子傳遞鏈的復合體Ⅰ內，與魚藤酮等抑制劑的結合位點極其接近。對線粒體呼吸鏈來講，并不需要明顯的損害，只要部分抑制便能導致自由基的形成及氧化應激。事實上，大鼠體內及成神經纖維瘤細胞體外實驗顯示，魚藤酮處理后的復合體Ⅰ抑制可導致蛋白質羰基水平增加，標志氧化應激的存在〔19，20〕。此外，在PD病人黑質觀察到脂質過氧化物及DNA和蛋白質氧化損傷的增加。在PD黑質中也觀察到了谷胱甘肽水平的降低，谷胱甘肽是一種自由基清除劑，它的降低進一步提示PD中存在氧化應激。

此外，由于基礎狀態下多巴胺在自身氧化及代謝過程中可產生自由基，因而多巴胺能神經元對額外增加的氧化應激尤為易感〔21〕。多巴胺有自身氧化并生成多巴胺-醌、超氧化物自由基及過氧化氫的傾向，所有這些物質或者本身就是高度活性分子或者能夠快速產生自由基。額外的氧化損傷如環境中線粒體毒素引起的氧化損傷能增加多巴胺能神經元的易感性。

氧化應激可直接或間接地影響UPS。蛋白酶體組分要么直接被氧化〔22〕要么被增加的氧化蛋白產物所抑制，這都可以導致細胞內損傷蛋白質的毒性聚集。多巴胺也能誘導PC12細胞UPS的抑制，這部分依賴于自由基的產生及多巴胺的再攝取〔23〕。此外，PD病人黑質低水平的蛋白酶體激活因子也能使黑質多巴胺能細胞對氧化及水解應激更易感〔24〕。

6 泛素-蛋白酶體系統的抑制、蛋白質的沉積及多巴胺細胞的死亡

理解UPS在PD發病機理中作用的一個方法是看UPS的損害能否復制PD的病理特征，這包括胞漿包含體的形成及選擇性的黑質-紋狀體通路的破壞。有人〔25〕將蛋白酶體抑制劑注射至紋狀體，導致酪氨酸羥化酶及DAT免疫染色的丟失，但是沒有明顯的GAD67免疫染色的丟失，這提示藥物引起紋狀體多巴胺終末的選擇性丟失。此外，紋狀體多巴胺及其代謝物DOPAC的水平是降低的，而5-羥色胺的水平沒有變化，證實了UPS抑制對黑質-紋狀體多巴胺能通路的選擇性毒性作用。紋狀體UPS抑制也導致黑質多巴胺能神經元的退行性變及殘留黑質神經元內胞漿包涵體的形成。體內及體外實驗顯示，抑制多巴胺的合成可減輕蛋白酶體抑制劑誘導的毒性，而增加多巴胺可用性的藥物則增強蛋白酶體抑制劑誘導的毒性，這提示UPS抑制對多巴胺能神經元及其終末的選擇性毒性作用依賴于內源性多巴胺的可用性〔26〕。但是，這并不能解釋為什么VTA多巴胺能神經元不受影響。可能的解釋是蛋白酶體亞單位在黑質及VTA神經元的差異性表達或者在這兩個區域蛋白酶體的功能角色不同。

新近報道，在SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞系，低水平的慢性蛋白酶體抑制可通過增加自由基的產生及降低復合體Ⅰ和復合體Ⅱ的活性顯著地改變線粒體的動態平衡〔27〕，這些改變有助于氧化應激。UPS的抑制可復制PD的突出的特征，因而證實了PD發病機制中涉及UPS功能的損害。

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