不同預(yù)處理方法對(duì)剩余污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

李建政，昌 盛，劉 楓

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱，ljz6677@163.com)

發(fā)酵法生物制氫，能以可再生的生物質(zhì)，甚至是富含生物質(zhì)的廢水、垃圾或禽畜排泄物為原料［1-5］，在清潔能源生產(chǎn)、廢物資源化和環(huán)境保護(hù)等方面均顯示出重要意義，展現(xiàn)出較好的發(fā)展前景［3，6-7］.以混合菌群(活性污泥)為基礎(chǔ)的發(fā)酵法生物制氫技術(shù)，其基本原理是產(chǎn)酸發(fā)酵細(xì)菌將有機(jī)物分解為有機(jī)酸(乙酸、丁酸)和乙醇等產(chǎn)物的同時(shí)，釋放H2和CO2［7］.大量研究表明，生物發(fā)酵制氫的種泥來(lái)源十分豐富，農(nóng)田土壤、城市污水處理廠的好氧污泥和消化污泥、市政排水管網(wǎng)下水道的底泥以及厭氧生物處理反應(yīng)器中的污泥均可作為產(chǎn)氫菌種來(lái)啟動(dòng)制氫反應(yīng)器［8］.然而，這些污泥中的微生物種類繁多，常有耗氫菌的存在，如產(chǎn)甲烷菌和同型產(chǎn)乙酸菌等，它們的耗氫行為，不可避免地會(huì)降低發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氫效能和延長(zhǎng)反應(yīng)器的啟動(dòng)時(shí)間［9-13］.為了最大程度地提高接種污泥中產(chǎn)氫菌的數(shù)量和活性，將耗氫菌的數(shù)量降到最低，縮短反應(yīng)器啟動(dòng)周期，國(guó)內(nèi)外研究中對(duì)接種至生物制氫反應(yīng)器的污泥采用了多種方法進(jìn)行預(yù)處理，但由于選用的種泥以及具體的處理?xiàng)l件不同，得出的結(jié)論各異，有的研究認(rèn)為熱處理最為合適［14-15］，有的認(rèn)為酸處理最為有效［16-17］，對(duì)各種預(yù)處理方法進(jìn)行全面對(duì)比分析的報(bào)道還較少［15］.本文以最易獲得的城市污水處理廠好氧活性污泥為對(duì)象，通過(guò)間歇發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)比分析了種泥經(jīng)酸、堿、熱、曝氣、氯仿——CHCl3和二溴乙烷磺酸鈉——BES等6種預(yù)處理方法處理后的產(chǎn)氫性能和發(fā)酵特性，以篩選出最為合適有效的預(yù)處理方法，尋求產(chǎn)氫菌的富集方法，為連續(xù)流生物制氫反應(yīng)器的快速啟動(dòng)以及提高系統(tǒng)的產(chǎn)氫效能提供指導(dǎo).

1 試驗(yàn)

1.1 種泥來(lái)源與預(yù)處理方法

試驗(yàn)采用的種泥取自哈爾濱市太平污水處理廠二沉池排放的剩余污泥，取得污泥后，經(jīng)淘洗過(guò)濾，去除污泥中的大顆粒物，沉淀0.5 h，去上清液后使用，其 MLSS、MLVSS分別為 20.35和14.43 g/L.取混勻污泥50 mL 8份，分別置于7個(gè)100 mL的燒杯中，按以下順序進(jìn)行各種預(yù)處理:①酸處理:用4 mol/L的HCl將污泥pH值調(diào)節(jié)為3，在攪拌下維持pH值穩(wěn)定5 min后，靜置24 h;②堿處理:用6 mol/L的NaOH將污泥pH值調(diào)節(jié)為10，在攪拌下維持pH值穩(wěn)定5 min后，靜置24 h;③熱處理:在100℃的水浴鍋中恒溫加熱處理30 min;④曝氣處理:以500 mg/L的質(zhì)量濃度加入葡萄糖，曝氣培養(yǎng)24 h;⑤CHCl3處理:以0.1%的體積分?jǐn)?shù)加入CHCl3溶液，磁力攪拌機(jī)下攪拌1 h后，靜置24 h;⑥BES處理:以10 mmol/L的濃度加入一定質(zhì)量的BES，磁力攪拌機(jī)下攪拌1 h后，靜置24 h;⑦第7個(gè)燒杯中未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的污泥作為空白對(duì)照.

1.2 培養(yǎng)方法

間歇發(fā)酵反應(yīng)器采用容積為296 mL的血清瓶.裝瓶方法為:每只滅菌血清瓶移入85 mL培養(yǎng)液后，用無(wú)菌注射器以15 mL的劑量接種經(jīng)不同方法預(yù)處理過(guò)的污泥或未經(jīng)處理的對(duì)照污泥(反應(yīng)體系中的污泥濃度(MLVSS)約為2 g/L)，并用1 mol/L的NaOH和HCl溶液將混合液的初始pH調(diào)為7.0;充高純氮?dú)? min，膠塞密封.接種完成后的反應(yīng)體系，總體積為100 mL，營(yíng)養(yǎng)組分如下(g/L):C6H12O6·6H2O 10.0;NH4C1 0.5; KH2PO40.5;K2HPO40.5;NaHCO34.0;MgC12· 6H2O 0.2;ZnSO4·7H2O 0.01;MnC12·4H2O 0.03;H3BO30.03;CoC12·6H2O 0.02;CaCl2· 2H2O 0.01;NiCl2·6H2O 0.02;Na2MoO4·2H2O 0.03;FeC12·4H2O 0.15.將密封后的血清瓶置于恒溫空氣浴振蕩器中，在150 r/min下35℃恒溫培養(yǎng)30 h.對(duì)照污泥和各預(yù)處理后的污泥樣品的培養(yǎng)，均采用3只培養(yǎng)瓶平行進(jìn)行，相關(guān)分析數(shù)據(jù)取3個(gè)平行反應(yīng)系統(tǒng)平均值.

1.3 分析方法

pH、MLSS和MLVSS采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定［18］，葡萄糖測(cè)定采用DNS法［19］.發(fā)酵產(chǎn)氣量采用10～100 mL的玻璃注射器定時(shí)排氣計(jì)量，并折算為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)(0℃，101.325 kPa)體積數(shù);發(fā)酵氣組分采用氣相色譜儀進(jìn)行分析［20］，累積產(chǎn)氫量參照Owen法進(jìn)行計(jì)量［21］.以無(wú)菌注射器定時(shí)從反應(yīng)瓶中抽取反應(yīng)液1.5 mL，6 000 r/min離心，取上清液0.5 mL 2份，分別用于葡萄糖質(zhì)量濃度和液相末端發(fā)酵產(chǎn)物(VFAs和乙醇)的分析.其中，VFAs和乙醇的分析采用另一臺(tái)氣相色譜儀測(cè)定［20］.

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氫量

在42 h的發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)照樣品及其他經(jīng)過(guò)預(yù)處理的污泥樣品的反應(yīng)體系中，所產(chǎn)生的生物氣中只含有H2和CO2，均未檢出CH4.然而，在Hu和Chen的研究中，未經(jīng)處理的污泥在降解糖類發(fā)酵產(chǎn)氫時(shí)，有CH4存在，造成這種差異原因可能是本文的接種污泥來(lái)源于城市污水處理廠的二沉池，污泥中的微生物以好氧和兼性菌種為主，僅含有少量甲烷甚至不含有產(chǎn)甲烷菌種，所以，本文的研究中，未經(jīng)處理的污泥進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫時(shí)，未檢測(cè)到CH4.圖1顯示了不同預(yù)處理方法對(duì)累積產(chǎn)氫量的影響，在發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行到24 h時(shí)，各發(fā)酵體系的累積產(chǎn)氫量達(dá)到最大值，分別為31.81(對(duì)照)、169.95(酸)、144.43(堿)、100.25 (熱)、72.98(曝 氣)、51.24(CHCl3)、28.32(BES)mL.發(fā)酵產(chǎn)氫反應(yīng)進(jìn)行到24 h之后，各發(fā)酵體系的累積產(chǎn)氫量都有一定量的下降，但并未檢出CH4.這一現(xiàn)象說(shuō)明，系統(tǒng)中存在著除甲烷以外的其他耗氫菌群，這與Bita和Yu等所報(bào)道的結(jié)果相似［14，22］.

圖1 不同預(yù)處理方法下的累積氫氣產(chǎn)量

式中:H為累計(jì)產(chǎn)氫量(mL)，Pmax為最大產(chǎn)氫量(mL);Rmax為最大產(chǎn)氫速率(mL/h)，λ為延滯時(shí)間(h).

利用Origin 8.0軟件進(jìn)行擬合的結(jié)果見(jiàn)表1，改進(jìn)的Gompertz模型比較適合于描述反應(yīng)過(guò)程中累積產(chǎn)氫量的變化，復(fù)相關(guān)系數(shù) R2均大于0.99.除了經(jīng)過(guò)BES預(yù)處理的污泥樣品外，其他經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的污泥樣品對(duì)葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵獲得的最大產(chǎn)氫量(Pmax)和最大產(chǎn)氫速率(Rmax)都遠(yuǎn)大于未處理的污泥.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15，17］，對(duì)糖類進(jìn)行厭氧發(fā)酵能代謝產(chǎn)氫的微生物主要以梭菌屬為了解發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)氫的動(dòng)力學(xué)特征，采用改進(jìn)的Gompertz模型(式(1))對(duì)得到的累積產(chǎn)氫曲線進(jìn)行了非線性擬合［23］:高和腸細(xì)菌為主，由于梭菌屬在極端環(huán)境下，如溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和化學(xué)藥物抑制劑下，能形成芽孢，具有自我保護(hù)功能.還有研究表明［15］，大部分梭菌屬和腸細(xì)菌能在少量氧氣存在下存活.而產(chǎn)甲烷和同型產(chǎn)乙酸菌等則屬于嚴(yán)格的厭氧菌屬，當(dāng)有氧氣存在時(shí)將失去活性.于是，當(dāng)污泥經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，相對(duì)于產(chǎn)甲烷和同型產(chǎn)乙酸菌種來(lái)講，梭菌屬和腸細(xì)菌仍得以存活下來(lái)的幾率要更大.因此，對(duì)污泥采用合適的預(yù)處理方法，在抑制產(chǎn)甲烷和同型產(chǎn)乙酸等耗氫菌群的同時(shí)，保持了產(chǎn)氫菌的活性，提高了發(fā)酵系統(tǒng)的最大產(chǎn)氫量和最大產(chǎn)氫速率.同時(shí)，對(duì)接種污泥采用不合適的預(yù)處理方法，有可能抑制住產(chǎn)氫菌的活性，而減小產(chǎn)氫效能［17，24］.在本文采用的預(yù)處理方法中，經(jīng)過(guò)BES處理的污泥，其Pmax和Rmax較對(duì)照的污泥樣品要小，而采用酸預(yù)處理后的效果最好，其Pmax和Rmax分別為171.14 mL和22.26 mL/h，堿處理次之，Pmax和Rmax分別為145.73 mL和20.73 mL/h，這與Lin等［16］的研究結(jié)果一致，而Wang等［15］的研究表明，采用熱處理的方法，獲得的效果最好，這可能是由于種泥不同所致.

表1 不同預(yù)處理方法下的發(fā)酵產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在各發(fā)酵體系反應(yīng)的初期，由于接種污泥對(duì)新環(huán)境的調(diào)整適應(yīng)，均表現(xiàn)出一個(gè)或長(zhǎng)或短的延滯期.其中，經(jīng)CHCl3和BES處理過(guò)的污泥延滯時(shí)間(λ)較大，分別為9.37和7.85 h，這可能是由于藥劑的毒性作用所致;而經(jīng)曝氣、熱處理的污泥，其延滯期較短，分別為3.69和5.66 h;經(jīng)酸、堿處理的污泥，λ為6.8 h左右，與空白相當(dāng).這進(jìn)一步表明，采用污泥預(yù)處理的方法能有效富集產(chǎn)氫菌種，促進(jìn)厭氧活性污泥的產(chǎn)氫活性，并且不同的預(yù)處理方法對(duì)原始種泥的菌種選擇作用不同，獲得的效果也存在差異.

2.2 液相末端發(fā)酵產(chǎn)物

表2總結(jié)了對(duì)照及各種污泥樣品發(fā)酵體系在第42小時(shí)時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物各成分的濃度.由發(fā)酵產(chǎn)物組成分析可知，污泥樣品的預(yù)處理對(duì)其產(chǎn)酸發(fā)酵特征有直接影響.由于接種污泥為二沉池的剩余污泥，從污水處理廠取回即用，屬于好氧污泥，污泥中好氧微生物居多，所以，未經(jīng)處理的污泥，和經(jīng)曝氣、BES處理后的發(fā)酵反應(yīng)體系，發(fā)酵產(chǎn)物均主要以乙醇和乙酸為主，其中，經(jīng)曝氣預(yù)處理后，乙醇和乙酸摩爾分?jǐn)?shù)分別為50.3%、47.0%(表2)，屬典型的乙醇型發(fā)酵［8，25］，Ren等［25］也得到了相同的結(jié)果.經(jīng)過(guò)熱、CHCl3預(yù)處理的污泥，其代謝產(chǎn)物主要以乙醇、乙酸和丁酸為主，其摩爾分?jǐn)?shù)均在30%～40%，屬于混合酸發(fā)酵［8］.而經(jīng)過(guò)酸、堿預(yù)處理的污泥，其利用葡萄糖發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)氫的產(chǎn)物主要以丁酸和乙酸為主，摩爾分?jǐn)?shù)分別為40.2%、30.8%和44.9%、37.9%，表明酸、堿處理有利于丁酸梭菌屬產(chǎn)氫發(fā)酵菌群的富集，這與Yu和Lin等的研究結(jié)果一致［14，16］.以上結(jié)果表明，不同預(yù)處理對(duì)種泥原有微生物群落結(jié)構(gòu)的改變存在差異，這可能是導(dǎo)致在相同的培養(yǎng)條件下，各反應(yīng)體系表現(xiàn)出不同產(chǎn)酸發(fā)酵特征的主要原因，Guo等［25］的研究對(duì)這一觀點(diǎn)已經(jīng)提出了有力的證據(jù).

表2 預(yù)處理對(duì)液相末端發(fā)酵產(chǎn)物的影響mmol·L-1

由表2可以看出，經(jīng)過(guò)曝氣處理的污泥，其發(fā)酵產(chǎn)物中的丁酸濃度最小，僅為0.25 mmol/L，表明曝氣對(duì)丁酸梭菌屬的抑制作用較強(qiáng)，所以，在Guo和Ren等的研究中［8，25］，對(duì)污泥采用曝氣預(yù)處理，均能較快地實(shí)現(xiàn)間歇、連續(xù)流的乙醇型發(fā)酵，而對(duì)污泥采用酸、堿預(yù)處理后能形成丁酸型發(fā)酵［8，14］.同時(shí)，Li等［26］的研究表明，乙醇型發(fā)酵較丁酸型發(fā)酵其氫氣產(chǎn)率要更高，更利于產(chǎn)氫.然而，在本實(shí)驗(yàn)中，采用曝氣預(yù)處理形成的乙醇型發(fā)酵，獲得的產(chǎn)氫量較采用酸處理形成的丁酸型發(fā)酵類型時(shí)的要小(表1)，分析認(rèn)為，這可能是由于種泥中存在同型產(chǎn)乙酸菌所致.在文獻(xiàn)［8，25-26］中，曝氣預(yù)處理的時(shí)間一般在1周左右，而本文的曝氣處理僅為24 h，所以，短時(shí)間的曝氣難以有效抑制同型產(chǎn)乙酸菌種，而引起了代謝產(chǎn)物中乙酸摩爾分?jǐn)?shù)較大，占到總揮發(fā)酸產(chǎn)物的47.0% (表2)，而經(jīng)酸處理的發(fā)酵體系，乙酸摩爾分?jǐn)?shù)僅占30.8%(表2)，這表明經(jīng)24 h曝氣處理后的污泥，雖然顯著地激活了發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)乙醇菌種，但對(duì)可利用H2和CO2合成乙酸的同型產(chǎn)乙酸菌無(wú)明顯抑制作用.如圖1所示，第24小時(shí)后的氫氣體積下降，以及無(wú)CH4氣體檢出，也間接證明了系統(tǒng)中存在著同型產(chǎn)乙酸菌種.而同型產(chǎn)乙酸菌在發(fā)酵制氫系統(tǒng)中的作用，目前，已經(jīng)成為了一個(gè)熱門的研究課題，在Hallenbeck和Bita等［7，9］的研究中均有報(bào)道，其作用機(jī)制和經(jīng)濟(jì)有效的控制技術(shù)還有待深入研究.

2.3 葡萄糖的降解

未經(jīng)熱處理的和經(jīng)熱處理過(guò)的各污泥樣品，在發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程中，對(duì)葡萄糖的降解情況存在顯著差異，經(jīng)預(yù)處理的污泥，葡萄糖的降解率均大于未經(jīng)處理的發(fā)酵反應(yīng)體系.如圖2所示，經(jīng)過(guò)酸、堿、熱處理的污泥，其葡萄糖的降解率均達(dá)到了90%以上，其中經(jīng)熱處理的降解率最大，為91.6%.經(jīng)CHCl3和BES處理的污泥，其葡萄糖的降解率為70%左右，經(jīng)曝氣預(yù)處理獲得的葡萄糖降解率則為77.5%.以上結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)酸、堿處理的污泥，在能獲得最大產(chǎn)氫量和最大產(chǎn)氫速率的同時(shí)，還能獲得較高的底物降解率.因此，對(duì)于利用有機(jī)廢水進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫來(lái)講，以經(jīng)酸或堿預(yù)處理的好氧污泥作為接種污泥是較好的選擇.

圖2 不同預(yù)處理方法下葡萄糖的降解

2.4 生物量和pH

各發(fā)酵體系在反應(yīng)42 h后，其生物量都有大幅增長(zhǎng)(圖3)，分別從起始的2 g/L左右提高到了7.57(對(duì)照)、4.85(酸)、5.02(堿)、5.30(熱)、6.6(曝氣)、7.30(CHCl3)、8.58(BES)g/L.這一生物量增幅顯著高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的水平［15-16］.由于酸性末端產(chǎn)物的積累(圖3)，各反應(yīng)體系的pH也分別從初始的7降低到了3.83(對(duì)照)、4.35(酸)、4.54(堿)、3.88(熱)、3.95(曝氣)、3.93(CHCl3)、3.91(BES).當(dāng)pH小于4.0時(shí)，會(huì)嚴(yán)重抑制活性污泥微生物的代謝活性［8］，這可能是導(dǎo)致對(duì)照、曝氣、氯仿、BES預(yù)處理污泥對(duì)葡萄糖的降解率較低的原因(圖2).

2.5 預(yù)處理剩余污泥對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫活性的影響

污泥經(jīng)其他方法預(yù)處理后，被滅活的微生物殘?bào)w與芽孢和具有活性的菌體一同被保留在污泥樣品中，是發(fā)酵系統(tǒng)中生物量(MLVSS)的組成部分.為此，以新增生物量的比產(chǎn)氫率為指標(biāo)，比較分析了不同發(fā)酵系統(tǒng)微生物群落的代謝活性.由于加入BES對(duì)好氧污泥微生物的選擇作用較小，未經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)BES預(yù)處理的污泥樣品，保留了原有的所有微生物類群.由于菌體數(shù)量基數(shù)大，經(jīng)42 h發(fā)酵后，其新增生物量MLVSS顯著高于其他預(yù)處理后的發(fā)酵體系，未經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)BES預(yù)處理的生物產(chǎn)量分別高達(dá)0.83和0.96 g(表3).經(jīng)酸、堿、熱、曝氣、CHCl3預(yù)處理的各污泥樣品發(fā)酵體系，其新增的生物量分別為0.31，0.35，0.37，0.56，0.78 g，其新增生物量的比產(chǎn)氫率分別為27.29，21.69，13.84，7.14，4.43 mol/kg，分別是未經(jīng)熱處理污泥樣品的10.45，8.31，5.30，2.74，1.70倍.從表3還可以看出，葡萄糖的氫氣轉(zhuǎn)化率與生物量的增長(zhǎng)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系，新增的生長(zhǎng)量越大，獲得的產(chǎn)氫轉(zhuǎn)化率越小，經(jīng)酸、堿預(yù)處理后的發(fā)酵系統(tǒng)，生物增長(zhǎng)量最小，其單位基質(zhì)葡萄糖的氫氣轉(zhuǎn)化率分別達(dá)1.51和1.34 mol/ mol，顯著高于其他的發(fā)酵系統(tǒng).以上分析表明，對(duì)好氧活性污泥采用適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，可顯著提高發(fā)酵產(chǎn)氫菌群的活性.

圖3 不同預(yù)處理?xiàng)l件下終止pH和生物量

表3 不同預(yù)處理方法對(duì)活性污泥發(fā)酵產(chǎn)氫特性的影響

3 結(jié)論

1)城市污水處理廠的好氧活性污泥采用合適方法的預(yù)處理，可以顯著提高其厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫活性.采用酸、堿、熱、曝氣、CHCl3均能有效提高種泥的發(fā)酵產(chǎn)氫活性，而采用BES的預(yù)處理不利于產(chǎn)氫.

2)各種預(yù)處理方法獲得的產(chǎn)氫效能由大到小依次為酸＞堿＞熱＞曝氣＞CHCl3＞BES，經(jīng)酸和堿處理的種泥樣品表現(xiàn)出良好的產(chǎn)氫效能，其葡萄糖的氫氣轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到 1.51和1.34 mol/mol，污泥的比產(chǎn)氫率分別為27.29和21.69 mmol/g，而未經(jīng)處理的污泥，其葡萄糖的氫氣轉(zhuǎn)化率和污泥的比產(chǎn)氫率僅分別為0.38 mol/ mol和2.61 mmol/g.

3)不同的預(yù)處理方法可導(dǎo)致種泥微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，在發(fā)酵葡萄糖時(shí)表現(xiàn)出不同的代謝特征.其中，經(jīng)酸、堿預(yù)處理的發(fā)酵體系表現(xiàn)為丁酸型發(fā)酵;經(jīng)曝氣、BES預(yù)處理的發(fā)酵體系表現(xiàn)為乙醇型發(fā)酵;經(jīng)熱、CHCl3預(yù)處理的發(fā)酵體系呈現(xiàn)為混合酸發(fā)酵特征.

［1］SOMPONG O T，PRASERTSAN P，INTRASUNGKHA N，et al.Optimization of simultaneous thermophilic fermentative hydrogen production and COD reduction from palm oil mill effluent by Thermoanaerobacterium-rich sludge［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33:1221-1231.

［2］GILROYED B H，CHANG C，CHU A，et al.Effect of temperature on anaerobic fermentative hydrogen gas production from feedlot cattle manure using mixed microflora［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33:4301-4308.

［3］REN Nanqi，LI Yongfeng，LI Jianzheng，et al.Progress of fermentative biohydrogen production process in China［J］.Journal of Chemical Industry and Engineering (China)，2004，55(suppl):7-13.

［4］CHONG M L，SABARATNAM V，SHIRAI Y，et al. Biohydrogen production from biomass and industrial wastes by dark fermentation［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2009，34:3277-3287.

［5］雷國(guó)元，王丹鴛，王建龍.有機(jī)固體廢物生物法制氫的研究進(jìn)展［J］.化工環(huán)保，2007，27(6):525-531.

［6］DAS D，VEZIROGLU T N.Advances in biological hydrogen production processes［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33:6046-6057.

［7］HALLENBECK P C.Fermentative hydrogen production: principles，progress，and prognosis［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2009，34(17):7379-7389.

［8］郭婉茜，任南琪，王相晶，等.接種污泥預(yù)處理對(duì)生物制氫反應(yīng)器啟動(dòng)的影響［J］.化工學(xué)報(bào)，2008，59 (5):1283-1287.

［9］NATH K，DAS D.Improvement of fermentative hydrogen production:various approaches［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，65(5):520-529.

［10］HAWKES F R，DINSDALE R，HAWKES D L，et al. Sustainable fermentative hydrogen production:challenges for process optimization［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2002，27(11/12):1339-1347.

［11］陳文花，劉常青，張江山，等.熱處理對(duì)污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響［J］.可再生能源，2007，25(2):56 -59.

［12］ZUO J，ZUO Y，ZHANG W，et al.Anaerobic biohydrogen production using pre-heated river sediments as seed sludge［J］.Water Sci Technol，2005，52(10/ 11):31-39.

［13］LIN Chiuyue，CHENG Chaohui.Fermentative hydrogen production from xylose using anaerobic mixed microflora［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2006，31:832-840.

［14］MU Y，YU H Q，WANG G.Evaluation of three methods for enriching H2-producing cultures from anaerobic sludge［J］.Enzym Microb Technol，2007，40: 947-953.

［15］WANG Jianlong，WAN Wei.Comparison of different pretreatment methods for enriching hydrogen-producing bacteria from digested sludge［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33:2934-2941.

［16］LIN C Y，CHOU C H.Anaerobic hydrogen production from sucrose using an acid-enriched sewave the sludge microflora［J］.Eng Life Sci，2006，41(4):66 -70.

［17］ZHU H G，BELAND M.Evaluation of alternative methods of preparing hydrogen producing seeds from digested wastewater sludge［J］.Int J Hydrogen Energy，2006，31(14):1980-1988.

［18］國(guó)家環(huán)保局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法［M］.4版.北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002:254-256.

［19］MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959，31(3):426-427.

［20］李建政，王衛(wèi)娜，馬超，等.丁酸甲烷發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌群的選育及其丁酸降解特性［J］.科技導(dǎo)報(bào)，2008，26 (11):49-52.

［21］OWEN W F，STUCKEY D C，HEALY J B，et al.Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity［J］.Water Res，1979，13:485-492.

［22］BAGHCHEHSARAEE B，NAKHLA G，KARAMANEV D，et al.The effect of heat pretreatment temperature on fermentative hydrogen production using mixed cultures［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33:4064-4073.

［23］LAY J J，LEE Y J，NOIKE T.Feasibility of biological hydrogen production from organic fraction of municipal solid waste［J］.Water Res，1999，33(11):2579-2586.

［24］HU B，CHEN S L.Pretreatment of methanogenic granules for immobilized hydrogen fermentation［J］.Int J Hydrogen Energy，2007，32(15):3266-3273.

［25］REN Nanqi，GUO Wanqian，WANG Xiangjing.Effects of different pretreatment methods on fermentation types and dominant bacteria for hydrogen production［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2008，33:4318 -4324.

［26］LI Jianzheng，ZHENG Guochen，HE Junguo，et al. Hydrogen-producing capability of anaerobic activated sludge in three types of fermentations in a continuous stirred-tank reactor［J］.Biotechnology Advances，2009，27(5):573-577.