木糖發酵產乙醇絲狀真菌的鑒定及發酵特性

范金霞，楊 謙，姚 琳，陳 剛

(哈爾濱工業大學生命科學與工程系，150001哈爾濱，yangq@hit.edu.cn)

燃料乙醇因其污染小、具有環境友好型的特點，成為新型燃料資源有望取代日益減少的化石能源(如石油和煤炭)［1］.傳統乙醇發酵原料為玉米、淀粉等糧食作物，糧食短缺的今天這一生產方式受到很大的限制.木質纖維素物質(如農作物廢棄物、木屑、薯渣等)是世界上最為豐富的生物質資源［2］，由纖維素、半纖維素和木質素組成，其水解產物主要是葡萄糖和木糖.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能發酵葡萄糖但不能發酵木糖產生乙醇.80年代以來，眾多的學者進行了木糖菌種的篩選以及菌種遺傳工程改造研究，木糖發酵微生物主要集中在畢氏酵母(Pichia)，假絲酵母(Candida)和管囊酵母(Pachyso1en)3個屬［3］，構建基因重組菌常用的宿主菌種有釀酒酵母(S.cerevisiae)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和大腸桿菌(E. coli)［4-6］，對絲狀真菌的木糖發酵研究的很少.本試驗從自然界中篩選到一株絲狀真菌發酵木糖產乙醇的菌株，對其進行了形態學和分子生物學鑒定，同時對其發酵特性進行了研究.

1 試驗

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

cs-28由本試驗室分離，現已送至中國典型微生物研究所保存.E.coli Top10為本實驗室保存.樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)來自中科院微生物研究所.

1.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD-18T載體、DNAMarker(DL2000)購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒購自上海華舜生物公司，引物合成和測序由上海生工生物技術有限公司完成;木糖購自美國Sigma公司;其他試劑均為國產分析純試劑.

1.1.3 培養基

初篩培養基(PXA):馬鈴薯200 g·L-1，木糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH值自然.

復篩培養基:木糖2%，酵母粉0.4%，蛋白胨0.2%，(NH4)2SO40.6%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2‰，CaCl20.1‰.

發酵培養基:KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2‰，CaCl20.1‰，碳源2%，氮源1.2%.

種子培養基(PX培養基):馬鈴薯200 g· L-1，木糖20 g·L-1，pH值自然.

PDA培養基:馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g ·L-1，瓊脂20 g·L-1.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離，純化和篩選

取1 g采集的土樣溶于10 mL無菌水中30℃振蕩1 h，經適當稀釋后，涂布于PXA平板上，30℃恒溫培養48 h;挑取生長較快菌落，經多次分離純化，將獲得的絲狀真菌純培養物保存.純化后的單菌落經復篩培養基進行杜氏管發酵試驗進一步篩選，最后利用發酵培養基進行乙醇質量濃度的測定，挑選出乙醇產量最高的菌株作為下一步研究對象.

1.2.2 菌種鑒定

形態學鑒定參考文獻［7］.分子生物學鑒定根據18S rRNA ITS序列引物:T1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'，T2:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'.基因組DNA提取參見文獻［8］方法進行.PCR反應體系:所有PCR反應均在20 μL標準反應體系中進行，其中含2 μL Buffer緩沖液，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，每一引物均1 μL(10 mmol/L)，0.125 μL Taq酶，1 μL模板DNA，加無菌超純水至20 μL，于PCR儀上按94℃預變性5 min，然后按94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、1 min，循環32次，最后72℃延伸10 min.PCR產物的克隆測序:按照膠回收試劑盒說明回收目的片段，連接克隆載體，轉化大腸桿菌感受態細胞Top10，提取質粒DNA，雙酶切鑒定后，挑取陽性克隆子送至上海生工生物技術有限公司進行測序.測序結果利用NCBI網站的Blastn和DNASTAR進行序列比較分析.

1.3 分析方法

乙醇產量測定采用重鉻酸鉀比色法［9］.木糖質量濃度測定采用DNS比色法［10］.

1.4 發酵特性研究

1)不同碳源對乙醇產量的影響.選取12種不同的碳源，按質量比2%加入到發酵培養基中.

2)不同氮源對乙醇產量的影響.選擇12種不同的氮源，按質量比1.2%加入到培養基中，以2%的木糖作為碳源，獲得最佳氮源.

3)初始pH值對乙醇產量的影響.用鹽酸調節發酵培養基的初始pH值，分別為5.0、5.2、5.4、5.8、6.0、6.2，確定最佳的發酵酸堿條件.

4)不同溫度對乙醇產量的影響.將接種后的液體培養基分別放在20、24、26、28、30、32、34、36℃的培養箱中靜止培養，比較溫度對產乙醇的影響.

5)不同初始木糖質量濃度對乙醇產量的影響:在發酵培養基中加入質量比分別為2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的木糖進行發酵，比較乙醇產量.

2 結果與分析

2.1 菌種的分離，篩選和鑒定

2.1.1 菌種的分離與篩選

通過對30份土樣中篩選得到能在PXA培養基上生長的菌株58株，利用杜氏管發酵檢測到16種菌株能產氣，對其進行發酵試驗，測定乙醇產量，得到一株產乙醇量最高的菌株cs-28.通過cs-28與樹干畢赤酵母乙醇產量的比較可以看出，cs-28最高乙醇產量在發酵的第144小時，而樹干畢赤酵母在第96小時，cs-28產乙醇的周期比樹干畢赤酵母長，但乙醇產量高于畢赤酵母(圖1).

圖1 cs－28與樹干畢赤酵母乙醇產量的比較

2.1.2 形態學鑒定

將cs-28放在PDA培養基上培養.該菌株在培養2 d后菌落直徑超過2.5 cm，7 d達8～9 cm;在室溫(25℃)下，菌絲生長良好，棉絮狀至絨毛狀，最初白色，逐漸中央粉色，后期轉變為紫色，培養基反面深紫色(圖2).菌絲經棉蘭染色后顯微鏡觀察結果:菌絲有隔，分枝，透明;有大小兩種類型分生孢子(圖3(a))，小型分生孢子數量較多，從菌絲的側生而單出的瓶狀小梗上長出或從分生孢子梗上長出，不呈鏈生而是假頭狀著生，橢圓形、紡錘形、卵形、逗點形;大型分生孢子時常較少，產于粘孢團中或從分孢子梗上長出;鐮刀形、紡錘形;頂端細胞窄細;有隔，3～6個分隔(圖3(b)).

圖2 cs－28在PDA培養基中生長7 d的菌落形態

圖3 cs－28孢子的顯微觀察

2.1.3 分子生物學鑒定

以cs-28基因組DNA為模板，應用真菌通用的18s rRNA引物進行PCR擴增，得到大約500 bp片段(圖4)，將目的片段連接克隆載體pMD-18T后進行測序.利用DNASTAR軟件隊測序結果進行處理后，獲得了535 bp核苷酸序列.通過NCBI網站上Blastn(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進行相似性搜索，結果顯示與Fusarium oxysporum的相似性為100%，結合形態學觀察結果可以確定該菌株為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum).

圖4 cs－28 18s rRNA片段擴增結果

2.2 發酵特性

2.2.1 不同碳源對乙醇發酵的影響

選取12種不同的碳源進行發酵試驗，結果見圖5，cs-28對蔗糖、葡萄糖發酵產乙醇能力最強，對乳糖的發酵能力最弱.對12種碳源均有不同程度的乙醇發酵能力，其碳源應用譜廣泛，有望成為工業發酵待選菌種.

圖5 不同碳源對cs－28乙醇產量的影響

2.2.2 不同氮源對乙醇發酵的影響

不同氮源對cs-28發酵產乙醇的試驗結果見圖6.可以看出，有機氮源比無機氮源產乙醇的量高.在有機氮源中yeast extract的產乙醇量最高，達4.28 g·L-1，與黃豆面發酵效果持平，考慮到發酵成本，以下的發酵試驗中采用黃豆面作為氮源.在無機氮源中，硝態氮比銨態氮效果好.其中NaNO3的發酵效率最高，達2.61 g·L-1.

圖6 不同氮源對cs－28乙醇產量的影響

2.2.3 不同溫度對乙醇發酵的影響

溫度對乙醇發酵的影響很大，溫度過高會增加乙醇的蒸發，溫度過低影響菌體生長，從而影響乙醇產量.試驗結果(圖7)表明:隨著溫度的升高，乙醇產量逐漸升高，溫度為30℃時乙醇產量最高，隨后逐漸下降.

圖7 不同溫度對cs－28乙醇產量的影響

2.2.4 初始pH值對乙醇發酵的影響

初始pH值分別設為5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，隨著pH值的升高乙醇產量呈上升趨勢，pH為6.0時乙醇產量最高，為5.51 g·L-1，隨后又急劇下降(圖8).

圖8 不同pH對cs－28乙醇產量的影響

2.2.5 初始木糖質量濃度對乙醇發酵的影響

初始木糖質量濃度對乙醇產量的影響極大，隨著木糖質量濃度的增加，乙醇產量也逐漸增加，但是乙醇產率卻逐漸下降(圖9)，初始木糖質量濃度為20 g·L-1，乙醇產率最高，即木糖轉化率最高.

圖9 初始木糖質量濃度對cs－28乙醇產量的影響

3 討論

本試驗篩選到的發酵木糖產乙醇的菌種為尖孢鐮刀菌，據文獻［11-12］報道，尖孢鐮刀菌不僅能產生多種纖維素酶系和半纖維素酶系，同時還具有降解多環芳烴蒽和苯酚的能力［13-14］，這為環境固體廢棄物和多環芳烴物質的降解提供了優良菌種.Panagiotou G等［15］利用尖刀鐮刀菌F3實現纖維素的同時糖化和發酵.尖孢鐮刀菌利用硝態氮的能力優于銨態氮，這與Naim M S等［16］研究的結果一致.同樣是絲狀真菌，最適的發酵初始pH值不近相同，雖然都在微酸性條件下，尖孢鐮刀菌最適pH為6.0，而粗糙脈孢霉的最適pH為5.0［17］.不同菌種對糖質量濃度的適應能力不一樣，釀酒酵母在高糖溶液(300 g·L-1)中仍然可以進行發酵，而尖孢鐮刀菌的最適木糖質量濃度(20 g·L-1)，比Pachysolen tannophilus的最適木糖質量濃度［18］低，這可能與細胞膜透性和滲透壓有關［19］.

4 結論

1)篩選到一株發酵木糖產乙醇的菌種cs-28，經過形態學和生物學鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum).

2)最適的發酵條件溫度為30℃;pH值為6.0;最適有機碳源為酵母提取物，無機碳源為NaNO3.

3)尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)具有發酵多種碳源的特性，為秸稈的資源化利用和能源的生產提供了新的菌種資源.

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