膠束毛細管電動色譜法在線富集聯用技術靈敏檢測乳制品和飼料樣品中的三聚氰胺

摘 要 建立了膠束毛細管電泳（MEKC）在線富集技術靈敏檢測三聚氰胺的方法，采用場放大進樣 （FASS） 聯用膠束掃集（Sweep）測定多種樣品中的三聚氰胺。試樣用乙腈反復提取3次，在優化實驗條件下，三聚氰胺的檢測靈敏度提高了約1000倍，檢出限由原來的2 mg/L降到1.8 g/L （S/N ＝ 3）。本方法用于配方奶粉和動物飼料中三聚氰胺殘留的檢測，回收率在97.2%～105.0%之間； 相對標準偏差均小于4.5%（n＝4）。本方法具有檢測靈敏、方便易行、預處理簡單、干擾少，經濟環保和適用范圍廣等優點。

關鍵詞 膠束毛細管電動色譜；場放大進樣；掃集；三聚氰胺

1 引 言

三聚氰胺（Melamine）是一種重要的氮雜環有機化工原料，由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，少數不法分子為虛假提高飼料以及乳制品中蛋白質含量而非法添加三聚氰胺，導致牛奶、蛋類等生活必需品中的三聚氰胺含量超過限量值（雞蛋：2.5 mg/kg，嬰幼兒配方奶粉：1.0 mg/kg，奶類制品：2.5 mg/kg）。2008年發生三聚氰胺乳品事件引起公眾強烈關注。研究建立快速測定食品、乳制品中三聚氰胺含量的高靈敏分析方法具有十分重要的實際意義和應用價值。目前。測定三聚氰胺的方法有GC-MS法［1］、HPLC法［2～5］、LC-MS法［6～9］， 毛細管電動色譜法［10～17］，增強拉曼光譜法［18］和熒光光度法［19］等。李愛軍等［8］運用LC-MS檢測飼料中的三聚氰胺殘留，檢出限為 0.2 mg/kg；饒欽雄等［10］運用毛細管區帶電泳聯用二極管陣列檢測器測定雞蛋中的三聚氰胺，定量限為0.25 mg/kg；Tsai等［11］運用膠束掃集毛細管電泳法測定配方奶粉中的三聚氰胺，檢出限為10.9 g/L。黃暉等［19］運用CTMAB增敏熒光光度法測定牛奶中的三聚氰胺，檢出限為19 g/L。

毛細管電泳是近十幾年發展起來的分離技術，具有儀器簡單、高效快速、自動化高、經濟環保等優點，已成為生物化學和分析化學領域中發展最快的一種分離分析技術。本研究將堆積技術和掃集技術聯用測定三聚氰胺，采用場放大進樣聯用掃集毛細管電泳模式（FASS-sweep MEKC）檢測三聚氰胺，并將此方法用于實際多種類型樣品的檢測中。樣品不需要常規的復雜預處理過程。實驗結果顯示，本方法對三聚氰胺有非常好的富集檢測效果，靈敏度提高了約3個數量級，檢出限為1.8 g/L，在不同樣品中的檢測都具有很低的檢出限及很高的穩定性和回收率，效果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CAPEL105高效毛細管電泳系統 （Lumex，俄羅斯）；TH-3000高效毛細管電泳儀（天惠分離科學研究所）；未涂層石英毛細管（65 cm×75 m i.d.，有效長度50 cm）；三聚氰胺標準品（上海安譜科學儀器有限公司）；嬰兒配方奶粉、牛奶及動物飼料購于本地超市；其余試劑均為分析純；水為超純水（華晶微電子公司）。

標準溶液的配制：準確稱取三聚氰胺標準品，用20%甲醇溶液配制成2.000 g/L儲備液。避光 4 ℃保存。使用時根據需要稀釋成不同濃度的標準液。

樣品溶液的制備：稱取2.000 g不同品牌的配方奶粉，加入3 mL 乙腈，超聲 10 min，以 7000 r/min離心6 min，吸出上清液，在下層沉渣中再加3 mL乙腈，操作方法同上，反復提取3次，合并上清液，并將其放入冰箱內冷凍5 min，取出后用濾紙過濾，然后用0.45 m過濾膜過濾得樣品溶液。所有溶液進入毛細管前均經過0.45 m過濾膜過濾，經超聲脫氣后使用。

動物蛋白飼料和牛奶的樣品處理方法同上。

2.2 毛細管預處理

毛細管在使用時，分別用0.1 mol/L HCl、超純水、0.1 mol/L NaOH、超純水、電泳緩沖液沖洗10 min。兩次樣品分析運行期間，分別用0.1 mol/L NaOH、超純水、電泳緩沖液沖洗5 min，以獲得良好的分離檢測重現性。

2.3 區帶毛細管電泳（CZE）體系考察了經典CZE體系對三聚氰胺的檢測效果。CZE電泳條件：壓力進樣3 kPa，進樣時間15 s， 運行緩沖液：20 mmol/L 10%（V/V）H3PO4-甲醇（pH 2.2），三聚氰胺溶液（8 mg/L）配制在運行緩沖液中。

2.4 場放大進樣-膠束掃集體系

2.4.1 MEKC條件 低pH條件可有效抑制電滲流，建立低電滲流體系。MEKC運行緩沖液的組成為90 mmol/L SDS溶液、20 mmol/L NaH2PO4（pH 2.2）、10%（V/V）甲醇。在分析中采用的運行條件：運行電壓－20 kV（檢測端位于正電壓一端），運行溫度20 ℃，檢測波長230 nm。

2.4.2 FASS-sweep MEKC運行模式 樣品基質為：0.10 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液（pH 2.2）、20% 乙腈，三聚氰胺溶液（1.0 mg/L）溶在樣品基質中。FASS-sweep MEKC方法：毛細管內充滿運行緩沖液，再加壓注入一段水柱（60 s，3 kPa），采用電動進樣（60 s，20 kV），水柱提供的高電場使樣品快速向出口端遷移，樣品離子遷移到水和背景緩沖液的界面，背景電解質提供低電場使樣品離子的遷移速度降低，從而在界面處形成一段樣品區帶。進樣完畢，進出口端均換上低pH膠束背景電解質，在負壓（－20 kV）下，運用膠束掃集樣品區帶，使樣品區帶更窄。

3 結果與討論

3.1 FASS-sweep MEKC 條件優化

3.1.1 電泳緩沖液的優化 為抑制電滲流，本實驗選用低pH值磷酸鹽緩沖體系。考察了SDS濃度、pH值、有機改性劑和分離電壓對分離效果的影響。實驗表明， 隨著SDS濃度增加，峰增高，出峰時間縮短。這是由于SDS增大了樣品的容量因子，樣品與膠束的作用增強，濃縮程度增加。SDS濃度大于90 mmol/L時，出現了峰形展寬、峰高降低的現象。最終選定90 mmol/L SDS溶液、 20 mmol/L NaH2PO4（pH 2.2）、 10%（V/V）甲醇為有機改性劑，分離電壓為－20 kV，此時分析物峰形良好、出峰時間短且富集效果最佳。

3.1.2 樣品基質的優化 考察了樣品基體溶液濃度從（0.1～10 mmol/L）對富集效果的影響。將樣品分別溶解在0.1～10 mmol/L NaH2PO4（pH 2.2）-20% 乙腈緩沖溶液中，在相同的實驗條件下利用場放大進樣-膠束掃集對樣品進行檢測。結果表明，樣品濃度較低（0.1或0.5 mmol/L）時，檢測靈敏度明顯增強，富集因子較高濃度樣品基質下提高約15%。這是因為在固定的進樣時間內，低濃度基體溶液在樣品進口端形成的低電場能推動更多的樣品離子進入毛細管，從而提高富集靈敏度。當基體溶液濃度低于0.10 mmol/L時，對靈敏度影響不大。選擇0.10 mmol/L NaH2PO4（pH 2.2）緩沖液作為樣品的基體溶液。結果表明，樣品在該濃度的基質溶液中檢測的靈敏度明顯增高。

3.1.3 進水進樣條件的優化 考察了壓力為3 kPa時，水塞進入時間（10～80 s）對富集效果的影響。實驗表明，隨著水塞進入時間的延長，樣品峰峰寬逐漸變窄，峰高明顯增加，富集效果增加;當水塞進入時間為60 s時，峰形良好，樣品的富集效果很好; 繼續增加水塞進入時間發現，峰形未變，且富集效果并沒有明顯增加。本實驗水塞進入時間選擇60 s。

其它條件不變，進樣壓力為20 kV，考察了進樣時間對富集倍數的影響。實驗表明：富集倍數隨進樣時間的延長而增加，當進樣時間超過60 s后，富集倍數較高，但峰形展寬，在頂端有平臺出現。本實驗采用60 s作為最佳進樣時間。

3.2 線性范圍、檢出限、回收率和相對標準偏差

分別采用CZE和FASS-sweep MEKC方法對6個空白的奶粉、牛奶和飼料樣品進行測定，測得基線噪聲平均值。配制1.0～8000 g/L標準品溶液，在最佳條件下測定，以3倍信噪比（S/N＝3）計算得三聚氰胺的CZE法和FASS-sweep MEKC法的檢出限（LOD）分別為2 mg/L和1.8 g/L。以峰面積y對樣品濃度x進行回歸分析， FASS-sweep MEKC法中三聚氰胺的峰面積與其濃度在5.0～1000 g/L范圍內呈線性關系： y＝1.81x＋0.743， R＝ 0.9991。在此實驗條件下，三聚氰胺的富集倍數比普通區帶毛細管電泳法提高了約1000倍（圖1和圖2）。遷移時間和峰面積的相對標準偏差 （RSD）分別小于5.2%和3.7%。

按照實驗方法進行回收率實驗，結果見表1，三聚氰胺的回收率在 97.2%～105.0%之間；其RSD均小于4.5%。

3.3 討論

毛細管電泳法具有分離效率高、時間短、重現性好、分離模式多種多樣等優點。相比于三聚氰胺的液相色譜測定方法，毛細管電泳的分析成本較低，檢測一個樣品消耗的緩沖溶液不足1 mL，經濟環保；另外，也不需要特殊的色譜柱，僅使用普通的空心毛細管柱，價格比一般的色譜柱低很多，使用方便。本實驗優勢在于使用了在線富集技術，使靈敏度提高了約3個數量級，彌補了毛細管電泳的在測量靈敏度上的缺陷。目前采用的方法如LC-MS法毛細管電動色譜法、膠束掃集毛細管電泳法和CTMAB增敏熒光光度法等，檢出限較高，本方法的檢出限為1.8

g/L。其次，本方法運用了電動進樣，這種進樣方法對進入毛細管中的成分是有選擇性的。在正向電壓下，不同極性的化合物在電泳和電滲的共同作用下先后進入毛細管中，陽離子化合物在正向電壓下首先被引入，從而克服了測量樣品中存在的一些中性基質分子或陰離子化合物的干擾。由于本方法的靈敏度高，富集倍數達到數千倍，在測量樣品時，可以將樣品溶液稀釋數倍后再電動進樣，進一步減少了樣品中非陽離子化合物基質的干擾。所以本方法中不需要采用常規的較為繁瑣的預處理方法也可以達到靈敏的檢測效果。

References

1 LI Feng-Ge， YAO Wei-Qin， TIAN Yan-He， DOU Hui（李鋒格， 姚偉琴， 田延河， 竇 輝）. Chinese Jourmal of Chromatography（色譜）， 2010， 28（3）: 319～322

2 Lin M， He L， Awika J， Yang L， Ledoux D R， Li H， Mustapha A. Journal of Food Science， 2008， 73（8）: T129～T134

3 WANG Hao ， LIU Yan-Qin ， CAO Hong ， YANG Hong-Mei ， LIU Xiao-Li ， YAN Long-Bao （王 浩， 劉艷琴， 曹 紅， 楊紅梅， 劉小力， 閆龍寶）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2008， 36（2） : 273 

4 Venkatasami G， Sowa J R. Anal. Chim. Acta， 2010， 665（2）: 227～230 

5 Wang G Y， Chen J， Shi Y P. Acta Chromatographica， 2010， 22（2）: 307～321

6 Deng X J， Guo D H， Zhao S Z， Han L， Sheng Y G， Yi， X H， Zhou Y， Peng T. J. Chromatogr. B， 2010， 878（28）: 2839～2844

7 Yu H， Tao Y F， Chen D M， Wang Y L， Liu Z Y， Pan Y H， Huang L G. Anal. Chim. Acta， 2010， 682（1-2）: 48～58

8 LI Ai-Jun， ZHANG Dai-Hui， MA Shu-Min（李愛軍， 張代輝， 馬書民）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2008， 36（5） : 699～701

9 CAI Qin-Ren， OUYANG Ying-Yu， QIAN Zhen-Jie（蔡勤仁， 歐陽穎瑜， 錢振杰）. Chinese Journal of Chromatography（色譜）， 2008， 26（3） : 339～342

10 RAO Qin-Xiong， TONG Jing， GUO Ping（饒欽雄， 童 敬， 郭 平）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2009， 37（9）: 1341～1344

11 Tsai I L， Sun S W， Liao H W， Lin S C， Kuo C H. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（47） : 8296～8303

12 Zana C， Ina R， Audrius P. Chemica， 2009， 20（4）： 231～235

13 Sun H W， Liu N， Wang L X， He P. J. Chromatogr. Sci.， 2010， 48（10）：848～853

14 Jin Y， Meng L C， Li M X， Zhu Z W. Electrophoresis， 2010， 31（23-24）: 3913～3920

15 Li X G， Hu J W， Han H Y．Journal of Separation Science， 2011， 34（3）: 323～330

16 LI Li-Jun， HAO Xue-Chao ， CHENG Hao，WU Qi-Tao（李利軍，郝學超，程 昊，吳啟濤）. Chinese Journal of Analysis Laboratory（分析試驗室） 2010， 29（1）: 76～79

17 Wu W C， Tsai I L， Sun S W， Kuo C H. Food Chemistry， 2011， 128（3）: 783～789

18 LI Jun-Mei， XU Xiao-Xuan， WANG Yu-Fang， WANG Bin， SUN Jia-Ming， ZHANG Chun-Zhou（李俊梅， 徐曉軒， 王玉芳， 王 斌， 孫甲明， 張有洲）. Spoectroscopy and Spectral Analysis（光譜學與光譜分析）， 2010， 30（10）: 2663～2666

19 HUANG Hui， LI Li， MA Qiao， FENG Yu-Chou， HE Zhi-Ke（黃 暉，李 麗，馬 喬，馮鈺鑄，何治柯）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（2）: 249～252

On-line Preconcentration and Sensitive Determination of Melamine in

Milk Powder and Animal Feeds Samples by

Micellar Electrokinetic Chromatography

CHEN Xin1， YUAN Hong-Ping2， CAO Yu-Hua1， CHEN Qiu-Yun1

1（School of Chemical and Material Engineering， Jiangnan University， Wuxi 214122）

2（Department of Textile and Chemical Engineering， Changzhou Textile and Garment Institute， Changzhou， 213164）

Abstract A sensitive analytical method using micellar electrokinetic chromatography with on-line preconcentration technique was developed for rapid determination of melamine in various samples. Two online preconcentration techniques including field-amplified sample stacking and sweeping micellar electrokinetic chromatographic technique （FASS- sweep MEKC） were used. The samples were extracted by acetonitrile for three times. Under the optimum conditions， the sensitivity was improved about 1000 times. The LODs was decreased from 2.0 mg/L to 1.8

g/L. The RSD were less than 4.5%. The recoveries were range in 97.2%－105%. This method is sensitive， reliable， economic and pretreatment-free for complex samples and can be easily used for product quality control of milk powder and animal feeds.

Keywords Micellar electrokinetic chromatography; Field-amplified sample stacking; Sweeping； Melamine

（Received 16 December 2010; accepted 10 June 2011）