基于二氧化硅球腔微電極陣列的過氧化氫生物傳感器制備

摘 要 以聚苯乙烯（PS）微球陣列為模板，采用溶膠-凝膠法在氧化銦錫（ITO）電極上制備了二氧化硅（SiO2）球腔陣列，掃描電鏡顯示此方法制備的SiO2球腔陣列高度有序。電化學(xué)研究結(jié)果表明，該球腔陣列的循環(huán)伏安曲線符合微電極陣列的電化學(xué)特點(diǎn)。將血紅蛋白（Hb）作為氧化還原模型蛋白直接吸附于球腔內(nèi)，制得電流型過氧化氫（H2O2）生物傳感器，研究了Hb在該微電極陣列上的直接電化學(xué)和電催化性質(zhì)。所構(gòu)建的傳感器對H2O2的響應(yīng)快速靈敏，其線性范圍為2.03×10－6～1.21×10－5 mol/L和2.03×10－5～1.21×10－2 mol/L；檢出限為5.73×10－7 mol/L，米氏常數(shù)為0.266 mmol/L。

關(guān)鍵詞 溶膠-凝膠法； 二氧化硅球腔； 微電極陣列； 血紅蛋白； 生物傳感器

1 引 言

由于電化學(xué)生物傳感器具有靈敏高、選擇性好、測定快速、結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)廉、能耗低且易于微型化和集成化等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是在時(shí)效、成本等高限定場合實(shí)現(xiàn)生物檢測的首選技術(shù)之一。然而，常規(guī)電極的檢出限受待測物質(zhì)傳質(zhì)速率和電極表面雙電層充放電電流的限制，對痕量物質(zhì)難以給出響應(yīng)，限制了其在痕量分析中的應(yīng)用。工作電極微型化是降低傳感器檢出限的有效手段之一。隨著電極尺寸的減小，物質(zhì)從本體溶液到電極表面的擴(kuò)散可由平面擴(kuò)散變?yōu)閺较驍U(kuò)散，改善了待測物質(zhì)的傳質(zhì)，電極面積的減小也有效降低了電極表面雙電層充放電電流，提高了測定信號的信噪比。通常單支微電極的響應(yīng)信號很微弱，可通過將多支微電極并聯(lián)組成的微電極陣列解決該缺點(diǎn)。微電極陣列不僅能有效放大響應(yīng)電流，還可保留單支微電極電化學(xué)特性，從而可在常規(guī)電化學(xué)儀器上獲得滿意的結(jié)果。

常見的微電極陣列的制備方法有自組裝法、刻蝕法和模板法等。這些方法通常需要昂貴的精密儀器或設(shè)備，制備條件繁雜苛刻，難以得到大規(guī)模的應(yīng)用。本研究小組曾以聚苯乙烯（PS）微球陣列為模板制備了二維氧化鋅（ZnO）球腔陣列，并證明了ZnO球腔電阻梯度的存在使球腔陣列具備了“軟”微電極陣列的功能，電化學(xué)反應(yīng)只在每個(gè)球腔的底部發(fā)生。本研究利用溶膠-凝膠法在氧化銦錫（ITO）電極表面制備規(guī)則有序、結(jié)構(gòu)完整的二氧化硅（SiO2）球腔陣列，該陣列的電化學(xué)行為類似于微電極陣列。將血紅蛋白（Hb）直接吸附于球腔內(nèi)部制備H2O2生物傳感器。結(jié)果表明，固定在SiO2球腔陣列內(nèi)部的Hb能保持良好的電化學(xué)活性，此傳感器對H2O2的響應(yīng)快速靈敏。本方法可方便調(diào)控球腔陣列密度，有望應(yīng)用于生物傳感器的設(shè)計(jì)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

612D型Langmuir槽（英國NIMA公司）；KYKY2800型數(shù)字化掃描電子顯微鏡（中國研究院北京科學(xué)儀器研制中心）；CHI660c電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；2xz-2型旋片式真空泵（上海儀表集團(tuán)供銷公司）。將3 mg Hb（Sigma公司）溶于1 mL PBS（pH 7.0）溶液中，配成3 g/L Hb溶液。無水乙醇、丙酮、正硅酸乙酯（TEOS）、30% H2O2、NaOH均為分析純（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ITO玻璃電阻小于100 Ω（蘇州板硝子電子有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 ITO電極的處理及PS微球模板的制備

用乳液聚合法制備PS微球，粒徑約為1500 nm \\。PS微球模板的制備方法同文獻(xiàn)\\。

2.3 溶膠的制備

將5 mL TEOS與60 mL乙醇混合，放入恒溫磁力攪拌器中劇烈攪拌，將6 mL水和1 mL 0.05 mol/L NaOH混合溶液用滴管慢慢加入，攪拌10 min后轉(zhuǎn)移至容量瓶超聲1 h，放置過夜。

2.4 Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列的制備

將修飾有PS微球單層膜的ITO電極放在制備好的SiO2溶膠液中，在真空干燥器中抽真空9 min（抽氣速率2 L/S，真空度﹤1.33 Pa），使微球與模板空隙中的空氣排出。當(dāng)體系恢復(fù)到常壓時(shí)，溶膠即填充到微球的空隙中。取出后于室溫干燥，再重復(fù)此過程一次。用乙酸乙酯除去PS微球，即得SiO2球腔微電極陣列。取10

L 3 g/L Hb溶液涂于SiO2球腔微電極陣列表面，置于冰箱中4 ℃干燥保存。使用前在PBS（pH 7.0）中洗掉附著不牢固的Hb，得到用于測定H2O2的生物傳感器，制備示意圖見圖1。

分 析 化 學(xué)第39卷

第9期周麗娟等: 基于二氧化硅球腔微電極陣列的過氧化氫生物傳感器制備

圖1 Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列制備過程示意圖

Fig．1 Schematic illustrations of fabrication of hemoglobin （Hb）/SiO2 cavities/indium-tin oxide （ITO） microelectrode array

2.5 實(shí)驗(yàn)方法

電化學(xué)測試采用三電極體系: 飽和甘汞電極為參比電極，鉑片（2 mm×7 mm）為輔助電極，修飾ITO的電極陣列為工作電極。采用循環(huán)伏安（CV）法研究該電極上Hb的直接電化學(xué)和電催化性質(zhì)時(shí)先用氮?dú)猓∟2）除氧30 min，測試時(shí)PBS溶液保持N2氛圍，于室溫下測試。

3 結(jié)果與討論

3.1 SiO2球腔陣列表面形貌表征及其電化學(xué)

圖2為SiO2球腔陣列的形貌及電化學(xué)特性。SiO2球腔陣列具有較好的有序性（圖2A），相鄰球腔中心之間的間距約1500 nm，與PS微球的直徑相當(dāng)。SiO2凝膠為籠狀結(jié)構(gòu)，在電解質(zhì)溶液中具有一定的導(dǎo)電性，其電阻的大小與層厚相關(guān)。SiO2球腔底部的凝膠層最薄，甚至可能存在缺陷，使ITO電極表面直接暴露在溶液中，因而球腔底部導(dǎo)電性最好，電化學(xué)反應(yīng)優(yōu)先在球腔底部發(fā)生。與相同面積的裸ITO電極（圖2B-a）相比，F(xiàn)e（CN）3－/4－6電對在SiO2球腔修飾ITO電極氧化還原電流減小，CV曲線呈現(xiàn)S型（圖2B-b），與微電極陣列的CV行為相似，表明傳質(zhì)過程主要為徑向擴(kuò)散，在極短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到穩(wěn)態(tài)。因此，可認(rèn)為該球腔陣列為微電極陣列。由圖2C可見，在較高的掃速下可以得到純徑向擴(kuò)散的S型CV圖，單電極的徑向擴(kuò)散場之間不發(fā)生重疊。但在較低掃速（﹤50 mV/s）下出現(xiàn)峰形CV曲線，說明相鄰微電極之間的擴(kuò)散層存在一定交迭。根據(jù)相鄰球腔中心間距，此條件下擴(kuò)散層厚度約為750 nm。球腔微電極陣列擴(kuò)散示意圖見圖2D。

圖2 （A）SiO2球腔陣列的SEM圖， （B）不同電極的CV圖， （C）SiO2球腔在不同掃速下的CV圖 （D）SiO2球腔微陣列電極的擴(kuò)散示意圖

Fig．2 （A） SEM images of SiO2 cavities array; （B） Cyclic voltammograms of different electrodes; （C） Cyclic voltammograms of SiO2 cavities array at different scan rates; （D） Schematic illustration of radial diffuse on SiO2 cavities array

0.1 mol/L KCl-1 mmol/L K3\\， 掃速（Scan rate）: 100 mV/s。 a. ITO裸電極（ITO bare electrode）； b. SiO2球腔陣列（SiO2 cavities array）；v （1～8）: 25， 50， 75， 100， 150， 200， 250 and 300 mV/s.

3.2 Hb修飾SiO2球腔微電極陣列的直接電化學(xué)及對H2O2的電催化

不同修飾電極的電化學(xué)行為見圖3。直接吸附Hb的ITO電極雖也能觀察到Hb的電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但其氧化還原峰并不明顯（圖3a）。可能是大部分吸附在電極表面的Hb發(fā)生了變性，阻礙了電活性中心與電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移。未修飾Hb的SiO2球腔微電極陣列無氧化還原峰（圖3b），而吸附有Hb的SiO2球腔微電極陣列在－0.20 V左右可見一對明顯的氧化還原峰（圖3c），該氧化還原峰是Hb中血紅素輔基Fe/Fe（Ⅱ）電對得失電子所致。 圖3 不同電極的CV圖

Fig．3 Cyclic voltammograms of different electrodes

0.1 mol/L PBS （pH7.0）＋0.1 mol/L KCl， 掃速（Scan rate）: 100 mV/s. a. Hb/ITO 電極（Hb/ITO electrode）; b. SiO2球腔/ITO微電極陣列（SiO2 cavities/ITO microelectrode array）; c. Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列（Hb/SiO2 cavities/ITO microelectrode array）。 這個(gè)現(xiàn)象可以解釋為SiO2球腔親水性微環(huán)境有利于蛋白質(zhì)保持其天然構(gòu)型，而SiO2球腔底部微納反應(yīng)區(qū)對Hb的直接電子轉(zhuǎn)移起到了促進(jìn)作用。還原峰電位（Epc）為－0.251 V，氧化峰電位（Epa）為－0.152 V，ΔEp為99 mV，說明該電極反應(yīng)是準(zhǔn)可逆的。氧化還原式電位（E0）為－0.202 V，與文獻(xiàn)\\報(bào)道的Hb在3D金球腔修飾電極的電位接近。當(dāng)溶液中H2O2加入濃度為3.3 mmol/L時(shí)，還原峰峰電流由1.45

A增加到2.19

A（圖4），表明修飾在SiO2球腔微電極陣列上的Hb對H2O2的還原具有明顯的電催化作用。Hb對H2O2還原的電催化過程可表示為: 

H2O2＋2HbFe2HbFe＋2H2O

3.3 溶液pH及工作電位的選擇

在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)，Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列的CV圖均呈現(xiàn)一對峰型良好的氧化-還原峰。考慮到蛋白質(zhì)在近中性條件下能更好保持其活性， 故后續(xù)研究中選擇pH 7.0。

在不同的工作電位下， 傳感器對H2O2的響應(yīng)不同。隨著工作電位由0.2 V減小到－0.3 V時(shí)，電流響應(yīng)快速增大； 當(dāng)電位小于－0.3 V，電流增加趨勢變緩。考慮到工作電位越負(fù)，電活性物質(zhì)的干擾性越強(qiáng)，故本研究選擇－0.3 V為工作電位。

3.4 線性范圍與檢出限

圖5為連續(xù)加入H2O2溶液時(shí)Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列的電流響應(yīng)曲線。加入H2O2后，該電極陣列在6 s內(nèi)即可達(dá)到穩(wěn)態(tài)。峰電流與H2O2濃度在較低濃度和較高濃度時(shí)呈現(xiàn)不同的線性關(guān)系（圖5，插圖）。在2.03×10－6～1.20×10－5mol/L濃度范圍內(nèi)，線性回歸方程為Ipa（

A）＝0.003770＋0.6194C（mol/L），r為0.9982；在1.20×10－5～1.21×10－2mol/L范圍內(nèi)，線性回歸方程為I(xiàn)pa（

A）＝0.1172＋0.3830C（mol/L），r為0.9979。檢出限為5.73×10－7 mol/L。采用Lineweaver-Burk方程:1/Iss＝1/Imax＋K mapp/（ImaxC）估算出Hb催化H2O2的米氏常數(shù)為0.266 mmol/L。與相關(guān)報(bào)道［12～18］相比，該修飾電極陣列對H2O2具有良好的催化活性，且檢出限更低（表1）。

圖4 Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列對H2O2的電催化

Fig．4 Electrocatalysis of Hb/SiO2 cavities/ITO microelectrode arrays for H2O2

0.1 mol/L PBS （pH 7.0）＋0.1 mol/L KCl， 掃速（Scan rate）: 100 mV/s. a. Without H2O2； b. 3.3 mmol/L H2O2.

圖5 生物傳感器對連續(xù)加入的H2O2后的電流-時(shí)間響應(yīng)曲線 （插圖: H2O2的峰電流與其濃度的校準(zhǔn)曲線）

Fig．5 Typical current-time response curve of the biosensor with successive additions of H2O2 （Inset : Calibration curve between current and H2O2 concentration）

0.1 mol/L PBS（pH 7.0）＋0.1 mol/L KCl; 工作電位（Applied potential）: －0.3 V.

3.5 Hb修飾SiO2球腔微電極陣列的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將Hb/SiO2球腔/ITO微電極陣列浸入除氧后的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，在掃速為100 mV/s的條件下，連續(xù)掃描100圈，CV還原峰電流相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%。在H2O2濃度為3.3 mmol/L時(shí)，平行測定10次，CV還原峰電流相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%。所制備的傳感器在4 ℃的冰箱中保存30 d后測定，能保持原來響應(yīng)電流的80%。結(jié)果表明，Hb修飾SiO2球腔微電極陣列具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

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Abstract A silicon dioxide （SiO2） cavities array was fabricated on indium-tin oxide （ITO） electrode surface with the template of the polystyrene（PS） particles array by using sol-gel technique. The morphology of SiO2 cavities array was highly ordered which was obtained by scanning electrode microscope. The results of electrochemistrical study showed that the cyclic voltammetric （CV） curve of SiO2 cavities array was in accordance with that of microelectrodes array. Using hemoglobin （Hb） as model protein， an amperometric biosensor for detection of H2O2 was prepared by adsorbing Hb in SiO2 cavities directly. The properties of direct electrochemistry and electrocatalysis of Hb were studied by CV method. The response of the biosensor for H2O2 was fast. A linear relationship between current response and the concentration of H2O2 ranging from 2.03×10－6 to 1.21×10－2 mol/L was obtained with a detection limit of 5.73×10－7 mol/L. And the apparent Michaelis-Menten constant was 0.266 mmol/L.

Keywords Sol-gel technique; Silicon dioxide cavities; Microelectrode array; Hemoglobin; Biosensor

（Received 18 November 2010; accepted 1 March 2011）