糖胺聚糖的熒光標記及其與硫酸軟骨素抗體的相互作用

摘 要 以1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺為催化劑，將糖胺聚糖（肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素A，B，C，D，E）中糖醛酸的羧基與氨基熒光素中氨基偶聯，分別得到各熒光標記糖胺聚糖。將標記糖胺聚糖用點樣儀點在硝酸纖維素包被玻璃芯片上，分別探討其在硝酸纖維素薄膜上的保留率及其與硫酸軟骨素抗體（克隆號CS-56）的相互作用。結果表明，各種糖胺聚糖在硝酸纖維素膜中保留率顯著不同，硫酸軟骨素E（51.7%）＞硫酸軟骨素A（19.5%）＞硫酸乙酰肝素（16.4%） ＞肝素（14.1%） ＞硫酸軟骨素B（12.3%） ＞硫酸軟骨素D（10.8%）＞硫酸軟骨素C（10.7%）；定量計算得各種糖胺聚糖與CS-56結合能力: 硫酸軟骨素C＞硫酸軟骨素D＞硫酸軟骨素A＞硫酸軟骨素E，硫酸軟骨素B、肝素及硫酸乙酰肝素與CS-56無結合。

關鍵詞 糖胺聚糖；熒光標記；糖芯片；硫酸軟骨素抗體

1 引 言



糖芯片是繼基因芯片、蛋白芯片之后又一新興的生物芯片技術，它是根據糖與其它生物分子之間的特異性結合，將微量糖類化合物以共價或非共價作用固定于芯片上，進而對蛋白質、活體細胞、微生物等進行檢測、分析的方法。因其具有用量少、通量高、靈敏快速及信息量大等優點，已成為糖組學研究的強有力工具。目前，糖芯片研究多集中于單糖和寡糖芯片。多糖因其水溶性強，固定難度高，保留率無法預測等原因，使多糖芯片研究受到了極大的限制。對多糖進行熒光標記可檢測其在膜芯片中的固定情況，而熒光試劑的選擇和標記率都對后續多糖檢測及其與蛋白結合有重要影響。

糖胺聚糖（Glycosaminoglycans， GAGs）是一類重要的生物大分子，通過與體內各種生長因子、酶及細胞粘附因子等結合，調節多種生物學過程，例如抗凝血、腫瘤轉移、炎癥反應等。因此，探究GAGs與蛋白相互作用，對開發新的臨床藥物具有重要意義。關于GAGs熒光標記的研究，一是通過脫乙酰暴露氨基基團，再加入能與氨基反應的熒光試劑實現；二是采用還原胺化方法，將其還原端與胺基熒光素偶聯。

本研究利用GAGs中含有羧基這一化學結構特征，以1-乙基-3-（ 3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（N-（3-Dime-thylaminopropyl）-N-ethylcarbodiimide hydrochloride， EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide， NHS）為催化劑，將GAGs與氨基熒光試劑偶聯，獲得熒光標記糖胺聚糖。利用熒光標記技術，探討GAGs在硝酸纖維素薄膜上保留率，并進一步考察其與硫酸軟骨素抗體 （Monoclonal anti-chondroitin sulfate antibody， clone CS-56，CS-56）的結合情況，為硫酸多糖芯片的建立及多糖和蛋白相互作用研究提供了方法學參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FP-6200熒光光譜儀（日本Jasco公司）；SMZ1500體視顯微鏡（配備熒光附件，日本Nikon公司）； LC-20AD高效液相色譜儀 （配備RF-10Axl熒光檢測器，日本島津公司）； MicroCaster array tool 8 pin點樣儀和硝酸纖維素薄膜（英國Whatman公司）；Sephadex G-25凝膠（瑞典Pharmacia Biotech公司）；硅膠板G60 F254（德國Merck公司）；BIO-CAPT200M凝膠采集系統（美國SIM公司）；Gel-Pro Analyzer軟件（美國Media Cybernetics公司）。

硫酸軟骨素A（Chondroitin sulfate A， CSA），硫酸軟骨素B（Chondroitin sulfate B， CSB），硫酸軟骨素C1（Chondroitin sulfate C， CSC1），硫酸軟骨素D（Chondroitin sulfate D， CSD），硫酸軟骨素E（Chondroitin sulfate E， CSE），肝素（Heparin， HEP），硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate， HS），1-乙基-3-（ 3-二甲基氨丙基） -碳化二亞胺（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），2-嗎啉乙烷磺酸（2-Morpholinoethanesulfonic acid， MES），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA），硫酸軟骨素單克隆抗體（CS-56）， 生物素標記羊抗鼠抗體，辣根過氧化物酶-鏈霉親和素復合物（Streptavidin-peroxidase polymer），2-\\ethanesulfonic acid（HEPES），SIGMAFASTTM 3，3-Diaminobenzidine tablets （Fast DAB），均購自美國Sigma 公司；胺基熒光素（5-（2-carbohydrazinomethyl）-thioacetyl-aminofluorescein， AF，美國Invitrogen公司）；硫酸軟骨素C2（Chondroitin sulfate C， CSC2），從鯊魚頭骨中純化，本實驗室提供。

2.2 實驗方法

2.2.1 糖胺聚糖熒光標記 稱取適量 CSA，溶于0.1 mol/L MES緩沖液（pH 5.0）中，加入不同比例EDC和NHS，室溫反應3 h；用冷凍乙醇沉淀多糖-NHS酯，以8000 r/min離心2 min，收集沉淀；用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）溶解，并加入熒光試劑AF，室溫避光反應過夜。反應混合物用Sephadex-G25柱分離，去離子水洗脫，熒光檢測器檢測（λex/λem， 493/517 nm），收集標記后的多糖組分，凍干備用。

2.2.2 熒光標記糖胺聚糖的純度及含量分析 取少量熒光標記多糖，用去離子水溶解（1.0 g/L），點0.5

L到薄層硅膠板上，以正丙醇-水 （3∶1，V/V） 溶液為展開劑，層析10 min，用凝膠成像儀采集熒光信號。總糖含量用硫酸咔唑法測定。多糖的熒光強度，通過建立熒光標準曲線進行定量分析。

2.2.3 糖胺聚糖芯片的制備及其與CS-56結合實驗 將標記的糖胺聚糖分別配制成2.0，1.0，0.5和0.25 g/L溶液，用手動點樣儀將其點印在硝酸纖維素膜包被的玻片上，用熒光體視顯微鏡拍照記錄熒光強度。將點樣后的硝酸纖維素膜浸泡在用HBS （10 mmol/L HEPES， 150 mmol/L NaCI， pH 7.4）溶液配制的3% BSA中，37 ℃孵育1 h，用HBST（含0.02% Tween-20 HBS）清洗3次，每次3 min。加入CS-56抗體（用1% BSA稀釋1000倍），在37 ℃孵育2 h，并按上述清洗步驟清洗3次，再加入生物素化羊抗鼠抗體，37 ℃孵育1 h，清洗3次后，加入辣根過氧化物酶-鏈霉親和素復合物（用1% BSA稀釋1000倍）， 孵育30 min，充分清洗后，加入Fast DAB底物顯色。多糖保留率的考察實驗除了不加顯色底物Fast DAB外，其它步驟同上。將芯片在37 ℃干燥后，用體視顯微鏡拍照。結果用Gel-Pro Analyzer軟件進行灰度積分分析。

3 結果與討論

3.1 糖胺聚糖熒光標記

熒光標記是目前各種生物大分子標記最靈敏的方法之一。本研究使用的氨基熒光素具有較好的水溶性，且在pH 4～10下性能穩定，這有利于水溶性酸性多糖分子GAGs的標記。在MES 緩沖體系（pH 5.0）中，EDC先與GAGs中羧基反應形成氧異酰脲中間體，然后與熒光素AF中氨基反應，形成穩定酰胺鍵。未與AF反應的氧異酰脲不穩定，易水解。為減少過量熒光試劑對多糖生物功能的影響，控制合適的標記率十分重要。考慮到GAGs分子量多在10～50 kD，依據AF熒光強度，每50～200個糖殘基標記一個AF就可滿足后續檢測分析。具體操作中，采取加入過量EDC和NHS方法提高AF反應率。以硫酸軟骨素A為例，熒光標記反應步驟及化學機理見圖1。其它GAGs的標記過程與此類似。

圖1 硫酸軟骨素A的熒光標記過程

Fig．1 Fluorescent labeling process of chondroitin sulfate A

EDC和NHS常用于蛋白間或蛋白與其它生物分子之間的偶聯，所采用的方法有一步交聯法和分步交聯法。參照文獻\\，考察了一步標記和分步標記的有效性。一步標記法，先用過量EDC活化多糖，然后直接加入熒光標記試劑AF。研究發現，在一步標記法實驗過程中（圖1步驟a），隨著EDC比例的增加，產物熒光強度明顯降低（圖2a），其原因是該標記反應中過量的EDC會進一步活化AF中羧基，并導致AF分子內或分子間發生偶聯反應，從而降低AF熒光強度。為防止上述圖2 一步標記法（a）和分步標記法（b）EDC/COOH摩爾比對熒光試劑反應率和熒光強度的影響

Fig．2 Effect of different N-（3-Dime-thylaminopropyl）-N-ethylcarbodiimide hydrochloride （EDC）/COOH molar ratio on fluorecent labeling rate and intensty by one-step labeling （a） and multi-step labeling （b）

現象發生，本實驗采取了分步標記技術， 圖3 8種標記多糖TLC純度分析

Fig．3 Purity analysis of eight labeling polysaccharides by TLC

s. 胺基熒光素（5-（2-Carbohydrazinomethyl）-thioacetylaminofluorescein）;

a. 硫酸軟骨素A（Chondroitin sulfate A）; b. 硫酸軟骨素B（Chondroitin sulfate B）; c. 硫酸軟骨素C1（Chondroitin sulfate C1）; d. 硫酸軟骨素C2（Chondroitin sulfate C2）; e. 硫酸軟骨素D（Chondroitin sulfate D）; f. 硫酸軟骨素E（Chondroitin sulfate E）; g. 肝素（Heparin）; h. 硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate）。即多糖中的羧基先與EDC反應，形成氧異酰脲；然后與NHS反應，形成穩定的多糖-NHS酯；分離去除過量EDC后，再加入AF完成熒光標記， 能很好地解決一步標記中的缺陷（圖1步驟b）。

以硫酸軟骨素A為例，在不改變熒光試劑用量的條件下，增加EDC和NHS的摩爾比例可以明顯提高標記率（圖3）；但當比例超過一定量后，多糖熒光標記率基本不變。

反應體系中4倍羧基量的EDC/NHS足以生成最大量的CSA-NHS酯。繼續提高EDC和NHS無法生成更多的CSA-NHS酯，相應的標記率也不會隨之提高。

從圖3可知，分步標記技術中EDC與COOH的摩爾比不會對熒光效率產生影響。去除EDC后，各物料比條件下的產物熒光強度變化不大，這也是EDC能影響AF熒光效率的另一個佐證。

綜合考慮，進行分步法熒光標記糖胺聚糖效果理想，EDC， NHS和COOH的最佳摩爾比為4∶4∶1。其它GAGs標記均采用該比例。

3.2 熒光標記多糖純度及其含量分析

標記后多糖的純度使用簡便的TLC技術進行分析，所用的展開劑是正丙醇-水 （3∶1， V/V）溶液。由于展開體系中正丙醇約占75%，熒光標記多糖停留在原點，未反應的熒光試劑被展開，其RF＝0.85（圖4）。從圖4可知，所有經G-25 柱純化后的標記多糖中沒有殘余AF。

標記后的多糖含量以葡萄糖醛酸為標準品，用硫酸咔唑法進行定量分析（Y＝14.56X－1.98， R2＝0.995，n＝6）；標記后多糖的熒光強度以AF為標準品，運用熒光光譜儀（λex/λem 493/517 nm），通過建立熒光強度標準曲線（Y＝0.51X－0.14，R2＝0.997，n＝6）進行定量分析。通過計算多糖物質量和AF物質量，可以確定多糖的熒光標記率。各糖胺聚糖結構及標記率見表1。此標記方法適用與標記有糖醛酸的糖胺聚糖，可以達到0.4%～2%的熒光標記率，足以滿足后續分析需要。

3.3 熒光標記糖胺聚糖在膜芯片中保留率及其與CS-56作用

在確定各多糖標記率基礎上，將各熒光標記的糖胺聚糖點印到硝酸纖維素薄膜上，探討其保留率。糖胺聚糖是多羥基帶負電荷的線性大分子，熒光標記后帶有芳香苯環，它們通過氫鍵和疏水基團與硝酸纖維素作用達到固定目的。采用手動點樣儀將各標記多糖（2.0， 1.0， 0.5和0.25 g/L）點印到硝酸纖維素膜上，并用熒光體視顯微鏡采集圖像，結果見圖4A。雖然標記多糖的濃度相同，但由于其熒光標記率不同，從而顯示了不同的熒光強度。在保留率實驗中，由于各多糖結構不同，其與纖維素膜的吸附力不同，按照糖芯片常規洗脫步驟處理，在膜中的保留率有顯著不同（圖4B）。經洗滌后，各糖熒光強度均有所降低，當點樣濃度低于0.5 g/L，大部分GAGs的保留率較低。在2.0 g/L濃度下，各多糖保留率理想，其中CSE和CSA保留率較高，HEP和HS次之，CSB， CSC， CSD保留率較低。通過熒光強度可得到各糖胺聚糖在硝酸纖維素薄膜上的準確保留率，CSA為19.5%，CSB為12.3%，CSC為10.7%，CSD為10.8%，CSE為51.7%，HEP為14.1%，HS 為16.4%。CSE保留率很高，與其分子量大（870 kDa）、 圖4 各多糖經緩沖液洗滌前（A）后（B）熒光強度比較

Fig．4 Fluorecent comparison of polysaccharides before （A） and after （B） washed with buffer

標注a

Symbol~A@ f意義同圖3 （a～f are same as in Fig．3）粘度高有關；其余糖胺聚糖保留值為10%～20%。本實驗對多糖進行了熒光標記，偶聯了幾個稠和苯環增加多糖的非極性，即使如此， 糖胺聚糖在硝酸纖維素上保留率依舊不高。這些數據為計算多糖與蛋白準確結合率提供了有用參考。

運用上述自制熒光標記糖芯片，以特異識別硫酸軟骨素的抗體CS-56驗證本方法的可靠性，實驗結果見圖5。從圖5可知， CS-56主要識別CSC和CSD，還可識別CSA和CSE， 但不識別CSB， HS和HEP。

圖5 GAGs與CS-56相互作用后FAST-DAB顯示圖（A）。矯正前（虛線）后（實線）GAGs與CS-56結合力比較（n＝8）（B）

Fig．5 FAST-DAB staining graph after GAGs interact with CS-56（A） and binding ability comparison of GAGS with CS-56 before （dash） and after （solid） correction（n＝8） （B）

標注a

Symbol~A@ f意義同圖3（a～f are same as in Fig．3）.

CS-56能專一識別CSC，CSD和CSA，這與糖胺聚糖寡糖芯片文獻報道基本一致。本實驗還發現， CS-56與CSC結合力高于CSD和CSA。此外，CS-56還能與CSE結合。雖然CSC2的分子量（170 kD）遠遠高于CSC1（16.7 kD），但兩者與CS-56結合能力差別不大。如果不考慮保留率的差別，以CSC1結合CS-56的能力按100%計，則CSA， CSC2， CSD和CSE結合能力分別為43%， 130%， 98%和42%。如果進一步考慮各多糖在膜中的保留率，仍按CSC1結合CS-56為100%計，則CSA為30%，CSC2為92%，CSD為60%，CSE只有7%。CS-56不識別CSB， HEP和HS。

本實驗利用熒光標記技術探討了各種糖胺聚糖在硝酸纖維素膜芯片中保留率差異，而且提示了由于各多糖熒光標記率不同，其表觀結合強度并不能代表多糖與蛋白結合的強弱，必須進行熒光強度矯正后才能獲得正確結果，本方法為多糖與蛋白結合研究提供了參考。

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Fluorescent Labeling of Several Gycosaminoglycans and Their Interaction

with Anti-Chondroitin Sulfate Antibody

HAN Zhang-Run1， WANG Yu-Feng1， LIU Xin1， WU Jian-Dong1， CAO Huan1，

ZHAO Xia1， CHAI Wen-Gang1，2， YU Guang-Li*1

1（Key Laboratory of Marine Drugs， Ministry of Education， Shandong Provincial Key Laboratory of

Glycoscience and Glycotechnology， Ocean University of China， Qingdao 266003）

2（Glycosciences Laboratory， Faculty of Medicine， Imperial College London， Harrow， Middx HA1 3UJ， U.K）

Abstract The amino groups of aminofluorescein were covalently linked to the carboxyl groups of glycosaminoglycans （GAGs） （Heparin， Heparan sulfate， Chondroitin sulfate A， B， C， D and E） using 1-ethyl-3-（1，3-dimethylaminopropyl） -carbodiimide and N-hydroxysuccinimide as catalytic reagent， and the fluorescent labeled glycosaminoglycan was acquired， separately. The fluorescent labeled GAGs were printed on the nitrocellulose coated glass chips with a manual microarrayer. The retention rate of GAGs on nitrocellulose membrane was calculated after washing， and their interaction with monoclonal anti-chondroitin sulfate antibody （clone number CS-56） was further studied， separately. The experimental results showed that the retention rate was apparently different between GAGs， that is， chondroitin sulfate E （51.7%）＞chondroitin sulfate A （19.5%）＞heparan sulfate （16.4%）＞heparin （14.1%）＞chondroitin sulfate B （12.3%）＞chondroitin sulfate D （10.8%）＞chondroitin sulfate C （10.7%）. The interaction of GAGs with CS-56 was scientifically compared according to their retention rate on nitrocellulose glycoship， and after quantitatively calculation， the binding ability to CS-56 is: chondroitin sulfate C＞D＞A＞E， while chondroitin sulfate B， heparin and heparan sulfate did not show any interaction with CS-56.

Keywords Glycosaminoglycans; Fluorescent labeling; Polysaccharide chip; Monoclonal anti-chondroitin sulfate antibody

（Received 16 January 2011; accepted 12 March 2011）