親水性相互作用色譜-四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜測定蛋白食品中L-羥脯氨酸殘留

摘 要 建立了親水性相互作用色譜-四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜檢測含蛋白食品中的皮革水解蛋白標(biāo)示物L(fēng)-羥脯氨酸（L-HYP）的同時定性與定量分析方法。樣品中的L-HYP經(jīng)酶解后用乙腈沉淀蛋白，HLB小柱除去部分脂溶性干擾物，采用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行測定。本方法采用IDA結(jié)合EPI模式對試樣中的L-HYP進(jìn)行定性分析，并建立L-HYP的二級子離子譜庫。通過以MRM模式對L-HYP進(jìn)行定量分析，L-HYP在12種蛋白食品中平均回收率在73.4%～114.2%（n＝6）之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.5%～14.4%（n＝6）之間，可對試樣中的L-HYP在定性確證的同時進(jìn)行定量分析。

關(guān)鍵詞 L-羥脯氨酸；親水性相互作用色譜；四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜；皮革水解蛋白

1 引 言

皮革水解蛋白是利用皮革、皮鞋下腳料及動物毛發(fā)，經(jīng)水解提煉而生成的一種蛋白。由于水解過程中添加重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等重金屬鹽，具有潛在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我國“第二批食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單”。不法商販將皮革水解蛋白添加到乳與含乳食品中，以提高食品的表觀蛋白質(zhì)含量，對相關(guān)食品制造行業(yè)和消費(fèi)者身體健康造成的嚴(yán)重威脅。

L-羥脯氨酸（L-hydroxyproline，L-HYP，結(jié)構(gòu)式如表1）是組成動物膠原蛋白的特征性氨基酸。檢測皮革水解蛋白多以L-HYP為標(biāo)示檢測物，其檢測方法主要有比色法、毛細(xì)管電泳法、氨基酸分析儀、液相色譜法及液相色譜/質(zhì)譜法等。已有液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定L-HYP的報道均為采用選擇離子方式檢測，方法靈敏度較低；由于羥脯氨酸極性強(qiáng)，采用反相色譜分離時需要進(jìn)行衍生，方法繁瑣，并且不能完全進(jìn)行確證；此外，采用反相色譜分離需用離子對試劑增加L-HYP的保留性，因此色譜和質(zhì)譜的兼容性較差，無法滿足大量樣品同時檢測的需求。本研究采用親水性相互作用色譜-四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜對含蛋白食品中的L-HYP進(jìn)行定性與定量測定。親水性相互作用色譜能夠較好地分離多種氨基酸類，方法簡便，無需衍生，靈敏度高，同時由于使用高比例的有機(jī)相，與質(zhì)譜具有良好的兼容性，方法的靈敏度較高；可以滿足日常檢測中大量試樣同時檢測的需求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

API 4000 Q-TRAP 四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB 公司）； SHISEDO Nano Space高效液相色譜儀（日本資生堂公司）； Allegra X-22R 高速離心機(jī)（美國Beckman 公司）； 固相萃取裝置（美國Suplco 公司）。0.22

m有機(jī)相濾膜（德國CNW 公司）。HLB固相萃取小柱（200 mg，3 mL，美國Waters 公司）。

L-羥脯氨酸（L-Hydroxyproline）， L-茶氨酸（L-Theanine）， L-亮氨酸（L-Leucine）， L-異亮氨酸（L-Isoleucine）和L-精氨酸（L-Arginine）的標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99%， 美國Sigma公司）。牛胰蛋白酶14043 U/mg，豬胰蛋白酶14670 U/mg（美國Sigma 公司）； 乙腈、甲醇（ HPLC 純，J . T. Baker 公司）； 甲酸（ ACS 純，J. T. Baker 公司）及甲酸銨（HPLC純，德國CNW公司），實驗用水為超純水（Millipore系統(tǒng)生產(chǎn)）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別稱取0.0100 g標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解，乙腈稀釋并定容至10 mL，配制成10 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，有效期為12個月。

吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用基質(zhì)空白溶液配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用時現(xiàn)配。

2.3 樣品前處理

稱取均質(zhì)固態(tài)試樣（奶油、餅干、奶糖、奶粉、奶酪、巧克力）1 g，或者液態(tài)試樣（液態(tài)奶、煉奶、冰淇凌）2 g（精確至 0.01 g），置于 50 mL塑料離心管中，加入適量 L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 mL 100 mmol/L甲酸銨緩沖鹽溶液，50

L蛋白酶液，漩渦混合2 min，50 ℃下酶解3 h后，加入5 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，以10000 r/min 離心5 min。HLB小柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，巧克力試樣過HLB小柱后直接收集樣液，所有試樣取樣液，過0.22

m濾膜，供LC-MS/MS測定。

分 析 化 學(xué)第39卷

第9期趙善貞等： 親水性相互作用色譜-四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜測定蛋白食品中L-羥脯氨酸殘留

2.4 色譜/質(zhì)譜條件

Waters Atlantis HILIC色譜柱 （150 mm×2.1 mm， 5

m）。流動相A：10 mmol/L甲酸銨（含0.2%甲酸）；流動相B： 5 mmol/L甲酸銨（含0.2%甲酸-乙腈（5∶95，V/V））；梯度洗脫程序： 0 min，100% B；6.0～10.0 min， 85% B；12.0～14.0 min，50% B，15.0～22.0 min，100% B。流速： 0.2 mL/min。進(jìn)樣量： 10

L。柱溫：常溫。 

離子源為電噴霧ESI源；掃描方式： 正離子模式；檢測方式： 多反映監(jiān)測MRM；電噴霧電壓（IS）： 5500 V；霧化氣壓力（GS1）： 0.345 MPa；氣簾氣壓力（CUR）： 0.172 MPa；輔助氣壓力（GS2）： 0.310 MPa；離子源溫度（TEM）： 500

SymbolpB@ C；CAD： High。定性離子對、定量離子對、碰撞氣電壓（CE）及去簇電壓 （DP）見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理和內(nèi)標(biāo)物的選擇

3.1.1 前處理條件的優(yōu)化 L-HYP屬于膠原蛋白的特征性氨基酸，因此在測定之前要對待測樣品進(jìn)行水解。常見的水解方法有酸水解及酶水解。本實驗采用6 mol/L 0.5%苯酚鹽酸溶液和胰蛋白酶對豬皮進(jìn)行水解。結(jié)果表明，酸水解產(chǎn)物對質(zhì)譜信號有強(qiáng)烈抑制作用，而酶水解對質(zhì)譜信號抑制作用較小。

L-HYP屬于強(qiáng)極性水溶性氨基酸。本研究采用與流動相一致的甲酸銨緩沖液進(jìn)行酶解，酶解后用高比例乙腈稀釋，同時沉淀蛋白質(zhì)，離心后直接進(jìn)樣檢測，無需進(jìn)一步處理。巧克力試樣基質(zhì)組成復(fù)雜，在檢測過程中基質(zhì)干擾較大，需通過固相萃取小柱凈化。比較4種不同類型的SPE柱（石墨化炭黑、氨基柱、C18和HLB）發(fā)現(xiàn)，石墨化炭黑和氨基柱對L-HYP具有較強(qiáng)的吸附作用，較難洗脫。而在C18和HLB中，HLB去除脂溶性干擾物的效果較好。

3.1.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 LC-MS/MS法測定L-HYP時存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，由于L-HYP尚無商品化的同位素內(nèi)標(biāo)，本研究采用與L-HYP結(jié)構(gòu)相似的3，4-脫氫-羥脯氨酸作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析，但考察回收率發(fā)現(xiàn)，該化合物對L-HYP的定量準(zhǔn)確度存在較大偏差。本研究改用茶氨酸作為L-HYP的內(nèi)標(biāo)。茶氨酸為茶葉中特有的氨基酸，不存在于膠原蛋白、原料乳、乳制品及豆奶、豆粉、蛋白粉等不含茶葉的植物源性食品中，取得了較好的定量結(jié)果（表3）。

3.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

3.2.1 液相色譜條件的優(yōu)化 L-HYP在檢測過程中存在多種干擾物，其中亮氨酸和異亮氨酸與目標(biāo)待測物L(fēng)-HYP分子量相同，在低分辨率質(zhì)譜上無法分離，同時這兩種氨基酸也是組成蛋白質(zhì)的主要氨基酸。本方法選擇的內(nèi)標(biāo)物茶氨酸是精氨酸的同分異構(gòu)體。在前期的質(zhì)譜優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，這些元素組成相同的氨基酸的子離子也基本相同，

因此在質(zhì)譜無法進(jìn)行分離的條件下只能通過色譜分離。氨基酸類物質(zhì)屬于小分子強(qiáng)極性化合物，普通的反相柱難以分離這類物質(zhì)。本實驗采用HILIC柱對這類物質(zhì)進(jìn)行分離。與普通反相柱相比，在不添加任何離子對試劑的條件下，HILIC柱對極性物質(zhì)有很好的保留能力；同時采用高比例有機(jī)相分離，具有較高的靈敏度高，與質(zhì)譜檢測接口具有良好的兼容性。通過比較不同濃度的鹽溶液（5，10和20 mmol/L），確定10 mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸），5 mmol/L甲酸銨（含0.2%甲酸）-乙腈（5∶95，V/V）作為流動相，梯度洗脫。結(jié)果表明，該流動相對氨基酸具有較好的分離效果，如圖2所示。

3.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 取10 mg/L的L-羥脯氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-茶氨酸及L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以流動注射的方式在電噴霧正模式下進(jìn)行母離子以及子離子掃描，并優(yōu)化去簇電壓、碰撞氣電壓等參數(shù)條件，以達(dá)到最佳靈敏度。L-HYP選擇\\＋（m/z 132.1）為準(zhǔn)分子離子峰，失去一分子CO2H2，得到m/z 86.2的子離子；再失去一分子H2O，得到m/z 68.3的子離子；其中m/z 132.1/68.3為定量離子對。而L-亮氨酸、L-異亮氨酸分別失去兩分子CH3以及一分子NH2，得到m/z 86.2的子離子；再失去一分子H2O，得到m/z 68.3的子離子，兩對子離子也與L-HYP子離子一致。

3.2.3 EPI模式的特征 優(yōu)化L-HYP在EPI模式下的CE值，以獲得足夠碎片離子的碎片圖譜。結(jié)果表明CE值為25 V時，得到的碎片信息最適合L-HYP分析。對5 mg/kg奶酪添加試樣進(jìn)行分析，m/z 132.1為母離子，m/z 86.2和68.3為子離子，靈敏度較好，可確證奶酪中存在L-HYP。

EPI掃描模式能夠提供高靈敏度的檢測方式，提高定性分析能力。本研究比較了奶酪添加MRM圖譜和EPI圖譜的靈敏度（圖3），MRM圖譜中m/z 132.1/68.3離子對靈敏度較差，而EPI圖譜的母離子及兩對子離子靈敏度均較好?？梢奅PI模式的靈敏度遠(yuǎn)高于MRM模式。

以EPI模式掃描1.0 mg/L L-HYP標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立L-HYP的碎片譜庫，并將奶酪添加圖譜的碎片圖譜和譜庫中L-HYP的碎片圖譜進(jìn)行比較（圖4），比較其相似度（FIT）和反相似度（RevFIT）值。相似度和反相似度反映了待測試樣圖譜和標(biāo)準(zhǔn)圖譜的相似程度。本實驗中奶酪添加圖譜和L-HYP圖譜的相似度值（79.002）和反相似度值（79.779）均較高。在實際試樣分析測定中，待測試樣和L-HYP標(biāo)準(zhǔn)溶液的定性離子對出峰時間一致；待測試樣和L-HYP標(biāo)準(zhǔn)溶液的碎片圖譜有較高的相似度，可以簡化對L-HYP的定性測定。

3.3 方法學(xué)驗證

3.3.1 基質(zhì)效應(yīng)的影響 液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行檢測時，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，導(dǎo)致目標(biāo)化合物發(fā)生離子增強(qiáng)或抑制作用，在儀器靈敏度允許的條件下，可以通過減小進(jìn)樣體積、稀釋樣品降低基質(zhì)效應(yīng)對定量準(zhǔn)確度的影響；也可以通過優(yōu)化色譜分離、樣品前處理以及使用同位素內(nèi)標(biāo)降低基質(zhì)效應(yīng)。按照上述選定的分析條件，在不同基質(zhì)中分別添加5 mg/kg的L-HYP，平行進(jìn)樣3次，對上述不同基質(zhì)添加5 mg/kg L-HYP的峰面積進(jìn)行歸一化處理: A（%）＝As/Amax×100，其中Amax為L-HYP標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，As為L-HYP添加在不同基質(zhì)中的峰面積。由于基質(zhì)差異，L-HYP在不同基質(zhì)中峰面積有顯著差異，基質(zhì)抑制率在12.5%～98.2%之間，特別是在奶粉、奶酪、巧克力等基質(zhì)中存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。因此本研究采用基質(zhì)匹配結(jié)合內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

3.3.2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢測下限（LOQ）

L-HYP屬于違法添加的非食用物質(zhì)，在最終產(chǎn)品中不得檢出。按照10倍信噪比（S/N）確立方法的定量檢測下限（LOQ），原料乳、奶油、奶糖、餅干、豆粉、

蛋白粉的LOQ為1.0 mg/kg；煉奶、冰激凌、豆奶的LOQ為2.0 mg/kg；奶粉、奶酪、巧克力的LOQ為5.0 mg/kg。方法線性范圍為1.0～20.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99。

3.3.3 添加回收實驗 對不含L-HYP的空白樣品進(jìn)行添加回收和精密度實驗。樣品添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)后，按本方法進(jìn)行提取、凈化和測定。采用本方法對液態(tài)奶、奶粉、煉乳、奶酪、奶油、冰激凌、奶糖、餅干、巧克力等原料乳、乳制品、含乳制品；豆奶、豆粉、蛋白粉等植物源性食品中的L-HYP進(jìn)行定量測定，部分分析結(jié)果見表3和圖5。由表3可見，3個添加水平平均回收率在73.4%～114.2% （n＝6）之間；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～14.4%（n＝6），方法的回收率和精密度良好。

4 結(jié) 論

本方法采用液相色譜-四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜對含蛋白食品中的L-HYP進(jìn)行同時定性和定量分析。以IDA結(jié)合EPI掃描模式對L-HYP進(jìn)行定性分析，同時以MRM模式進(jìn)行定量測定，方法簡便、快速，可以滿足目前對蛋白食品中皮革水解蛋白標(biāo)示物L(fēng)-HYP的檢測需要。

References

1 Ministry of Health of the P. R. China. On the Issuance of Notice Regarding the List （second batch） of Potential Non-food Substances Added Illegally to Food.衛(wèi)生部， 關(guān)于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批）》的通知， http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s3594/200902/38987.htm， 2009

2 TIAN Yan-Ling， SUN Yan， CHEN Jing， SUO Ya （田艷玲， 孫 妍， 陳 婧， 索 婭）. China Dairy Industry（中國乳品工業(yè)）， 2009， 37（6）： 49～50 

3 ZHAO Tian-Zhen， YUAN Xiu-Jin， TAN Gui-Liang， JIANG Ying-hong， LU Wei， GU Kai， LI Xiang-Li （趙天珍，袁秀金，譚貴良， 江迎鴻，盧 蔚，顧 凱，李向麗）. Food Research and Development（食品研究與開發(fā)）， 2008， 29（12）： 111～113

4 XUE Jing， LIANG Heng， LI Tian， WU Ya-Yan （薛 靜， 梁 恒， 李 甜， 武亞艷）. Chinese J.Anal. Chem．（分析化學(xué)）， 2005， 33（6）： 785～788 

5 WANG Sheng， SHI Lai-Feng， A LI TENG-Cai Si Ke， ZHAO Xiao-Feng （王 昇， 石來鳳， 阿力騰才斯克， 趙曉鳳）. China Dairy（中國乳業(yè)）， 2010， （6）： 54～55 

6 ZHENG Jia-Gai， WANG Fei， NONG Yun-Jun， SU Liu-Kun （鄭家概， 王 飛， 農(nóng)云軍， 蘇流坤）. Joural of Instrumental Analysis（分析測試學(xué)報）， 2008， 27（12）： 1383～1385

7 LI Jing-Hong， MENG Xiang-Chen （李景紅， 孟祥晨）. China Dairy Industry（中國乳品工業(yè)）， 2008， 36（11）： 56～59

8 SUN Yan-Ting， LU Kui， MA Li， CAO Shu-Xia， ZHAO Yu-Fen （孫艷亭， 盧 奎， 馬 麗， 曹書霞， 趙玉芬）. Chinese Journal of Chromatography（色譜）， 2007， 25（4）： 524～527



9 XIA Jin-Gen， CHEN Bo， YAO Shou-Zhuo（夏金根， 陳 波， 姚守拙）. Chinese Journal of Chromatography（色譜）， 2008， 26（5）： 595～598

10 LI Yan-Chun， LIN Li-Qiang， WEI Dong-Fa， HU Guang-Mei （李彥春， 靳立強(qiáng)， 危東發(fā)， 胡光美）. Chinese Leather（中國皮革）， 2002， 31（23）： 6～9

11 Deng X J， Guo D H， Zhao S Z， Han L， Sheng Y G， Yi X H. J. Chromatogr. B， 2010， 878（28）： 2839～2844

12 María J. M. Bueno， Ana A， María D. H， María J. G， Amadeo R. F. A. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（32）： 5995～6002

13 GUO De-Hua， DENG Xiao-Jun， ZHAO Shan-Zhen， ZHU-Jian， XIA Chong-Fei， CHEN Shun-Sheng， SONG Yue （郭德華， 鄧曉軍， 趙善貞， 朱 堅， 夏崇菲， 陳舜勝， 宋 越）. Chinese J.Anal. Chem．（分析化學(xué)）， 2010， 38（3） ： 318～324

14 Ann V E， Katrien L， Sophie S， Ilse S， Yvette M. J. Chromatogr. B， 2009， 887（23）： 2198～2207

Determination of L-Hydroxyproline by Hydrophilic Interaction

Chromatography Coupled Tandem Quadrupole Linear Ion

Trap Mass Spectrometry in Protein Contained Food

ZHAO Shan-Zhen1， DENG Xiao-Jun*1， PENG Tao2， YI Xiong-Hai1，

GUO De-Hua1， HAN Li1， SHENG Yong-Gang1， WU Qiao-Bin3

1（Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shanghai 200135）

2（Chinese Academy of Inspection Quarantine， Beijing 100025）

3（Shanghai Ocean University， Shanghai 200433）

Abstract A method based on hydrophilic interaction chromatography-quadrupole/linear ion trap-mass spectrometry （HILIC-q/LTQ MS） for qualitative and quantitative determination of L-hydroxyproline （L-HYP） as target compound in protein contained-food was presented. L-hydroxyproline in samples were extracted with acetonitrile after enzymolysis， followed by a further cleanup using HLB solid phase extraction column to remove lipid soluble interferes. The L-HYP residue was separated upon a hydrophilic interaction chromatography column and determined by quadrupole-linear ion trap-mass spectrometry. Information dependent acquisition scan function （IDA） combined with enhanced product ion scan （EPI） library was used to confirm the content of L-HYP， while quantification was operated by MRM mode. The recoveries ranged from 73.4% to 114.2% （n＝6） and the RSD between 2.5% and 14.4% （n＝6） in 12 kinds of protein contained matrices respectively.

Keywords L-Hydroxyproline; Hydrophilic interaction chromatography; Quadrupole-linear ion trap-mass spectrometry; Protein contained food

（Received 23 February 2011; accepted 27 May 2011）