薄層色譜-熱輔助水解甲基化-氣相色譜法測定生物柴油中的甘油酯

摘 要 建立了薄層色譜-熱輔助水解甲基化-氣相色譜法測定生物柴油中殘余甘油酯含量的方法。樣品中的甘油酯經(jīng)薄層色譜分離，萃取后與三甲基氫氧化硫 （0.1 mol/L） 各3

L先后加入到樣品杯中，在350 ℃下，于裂解器中進(jìn)行衍生化反應(yīng)，氣相色譜測定生成的脂肪酸甲酯，確定甘油酯的含量。生物柴油中常見的甘油一酯、二酯、三酯在 60～2000 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2為0.9863～0.9993。對于濃度為 250 mg/L 的4種甘油二酯重復(fù)測定 5 次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～7.2%。本方法對實際樣品中的甘油酯的測定結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確、靈敏。

關(guān)鍵詞 薄層色譜；熱輔助水解甲基化；氣相色譜；三甲基氫氧化硫；甘油酯；生物柴油

1 引 言

生物柴油是一種低硫、可再生的清潔燃料［1］，現(xiàn)已成為一種優(yōu)質(zhì)的石油柴油替代品。它是在催化劑 （酸或堿） 存在下，由動植物油與過量甲醇發(fā)生酯交換反應(yīng)制得的。通常因反應(yīng)不完全，生物柴油殘余少量甘油一酯、二酯、三酯。殘余的甘油酯過高會沉積在發(fā)動機(jī)閥門、活塞等部位，影響發(fā)動機(jī)的性能［2］。為了控制生物柴油的品質(zhì)，研究殘余甘油酯的定量分析方法非常重要。

現(xiàn)有的分析方法有氣相色譜法 （GC） ［3～6］、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法 （HPLC-ELSD） ［7，8］、薄層色譜-氫火焰離子化檢測器法 （TLC-FID） ［9］等。GC 是較常用的方法，但是甘油脂的分子量較大，需高溫 GC；HPLC-ELSD 法能夠用于甘油酯的分離，但是 ELSD 線性范圍較窄，靈敏度不夠高；TLC-FID 法能較好地分離甘油酯，但定量分析尚不夠準(zhǔn)確。

熱輔助水解甲基化-氣相色譜法 （Thermally assisted hydrolysis and methylation-gas chromatography， THM-GC） 已被應(yīng)用于脂肪酸甘油酯的分析［10］，這種方法是將甘油酯在線衍生化為脂肪酸甲酯進(jìn)行測定。由于生物柴油本身含有大量脂肪酸甲酯，因此僅用該法無法分析生物柴油中殘余的甘油酯。本研究將 TLC 與 THM-GC 兩種方法結(jié)合，即薄層色譜-熱輔助水解甲基化-氣相色譜法 （TLC-THM-GC），生物柴油經(jīng)薄層色譜分離，溶劑提取薄板上的甘油酯，采用在線熱輔助水解甲基化法將甘油酯在裂解器內(nèi)同時同步水解衍生為相應(yīng)的脂肪酸甲酯，氣相色譜測定所產(chǎn)生的脂肪酸甲酯，進(jìn)而確定甘油酯的含量。本方法能夠測定生物柴油中殘余的各甘油酯的含量，同時可有效分析甘油酯中脂肪酸的組成。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CP-3800 氣相色譜儀（美國Varian公司），配氫火焰離子化檢測器；5890/5972 氣質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Agilent公司） ； Py-2020iD 縱型微型爐裂解器 （日本Frontier Lab公司） 。

硬脂酸甘油一酯、二酯、三酯 （純品，美國 Accstandard 公司）；油酸甘油二酯、亞油酸甘油二酯、亞麻酸甘油二酯 （純度＞99%，美國 Nu-Chek 公司） ；三甲基氫氧化硫 （0.1 mol/L 甲醇溶液，日本東京化成工業(yè)株式會社） ；乙酸乙酯 （分析純，國藥集團(tuán)試劑公司） ；甲苯，丙酮 （分析純，衢州巨化試劑公司） ；GF254 硅膠板 （10 cm×20 cm，青島海洋化工有限公司） ；菜籽油、棕櫚油為原料的生物柴油樣品 （浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程研究所） 。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和生物柴油樣品溶液的制備

2000 mg/L甘油二酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取硬脂酸 （C18∶0）、油酸 （C18∶1）、亞油酸 （C18∶2）、亞麻酸 （C18∶3）、甘油二酯各 0.0100 g，定容至 5 mL。逐級稀釋得一系列溶液，濃度分別為 2000， 1000， 500.0， 250.0， 125.0和62.50 mg/L。

1900 mg/L甘油一酯、三酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取硬脂酸 （C18∶0） 甘油一酯和三酯各 0.0038 g，分別定容至 2 mL。逐級稀釋得一系列溶液，濃度分別為 1900， 950.0， 475.0， 237.5， 118.8和59.40 mg/L。

生物柴油樣品溶液：取生物柴油樣品 200 L，定容至 1 mL，得稀釋5倍后的溶液。

所有溶液皆用乙酸乙酯（分析純）作溶劑，進(jìn)行定容與稀釋，配制的溶液存放于 4 ℃ 冰箱中。

2.3 實驗方法

2.3.1 薄層色譜分離 取 100 L 上述標(biāo)樣及樣品點在長為 10 cm 的硅膠板上 （20個點，每點5

L） ，以甲苯-丙酮（92∶8， V/V） 為展開劑展開，使用碘蒸氣顯色。待各斑點褪色后，刮入試管中并加入乙酸乙酯2～4 mL （甘油一酯與三酯組分加2 mL，甘油二酯組分因斑點面積較大，硅膠較多，加 4 mL），超聲萃取45 min，以3000 r/min離心 10 min。取1～2 mL 上層清液 （甘油一酯與三酯取 1 mL，甘油二酯取2 mL），放入到小樣品瓶中，在110 ℃ 下， 于通風(fēng)櫥中加熱蒸發(fā)至干，加入50

L 乙酸乙酯，超聲輔助溶解。

2.3.2 THM-GC 法測定 取上述樣品3

L 加入到樣品杯中等待5 min 使溶劑揮發(fā)后，加入3 L 0.1 mol/L 三甲基氫氧化硫（Trimethylsulfonium hydroxide， TMSH），將樣品杯固定在進(jìn)樣桿上，裝入裂解器。儀器穩(wěn)定后，按下進(jìn)樣桿使樣品杯自由落到預(yù)先設(shè)定為350 ℃ 的爐心，樣品受熱瞬間發(fā)生水解甲基化反應(yīng)，生成的產(chǎn)物立即由載氣帶入氣相色譜進(jìn)行測定。

2.4 定量方法

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。將各甘油酯衍生化得到的各脂肪酸甲酯的峰面積總和代入到硬脂酸甘油一酯、二酯、三酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程，即可求得生物柴油樣品溶液中相應(yīng)的甘油一酯、二酯、三酯的含量，然后再乘以5 （稀釋倍數(shù)），即可求得生物柴油樣品中甘油酯的含量。

2.5 儀器工作參數(shù)

氣相色譜：DB-23 色譜柱 （30 m×0.25 mm×0.25

m） ；柱溫：初溫 80 ℃，以 20 ℃ /min 速率升到180 ℃，再以 5 ℃ /min 速率升到 230 ℃，保持 3 min。汽化室和檢測器溫度均為 250 ℃，分流比 30∶1，載氣 N2，柱流量 1 mL/min。 圖1 甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品和生物柴油樣品的薄層色譜圖

Fig．1 Typical chromatogram of glyceride standards and biodiesel sample obtained by TLC

1． 硬脂酸甘油一酯； 2． 油酸甘油二酯； 3． 硬脂酸甘油三酯； 4． 生物柴油樣品。 1. Monostearin； 2. Diolein; 3. Tristearin; 4. Biodiesel sample.

質(zhì)譜：EI 離子源 （由傳輸線傳遞溫度），電離能量 70 eV，掃描范圍 40～500 amu; 配備 Nist 02 譜庫。

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層色譜分離和定性

以 GF254 硅膠板作為薄層色譜的固定相，選擇甲苯-丙酮 （92∶8， V/V）為展開劑，用碘蒸氣顯色。如圖1所示，從左到右依次是硬脂酸甘油一酯，油酸甘油二酯，硬脂酸甘油三酯，生物柴油樣品。計算得到甘油一酯Rf 值為0.06；甘油二酯Rf 值為0.40和0.55，是同分異構(gòu)體［11］；甘油三酯的Rf 值為0.92。生物柴油樣品中觀察到Rf 值分別為0.06，0.40，0.55，0.92的4個斑點，與標(biāo)準(zhǔn)品比較，可定性為甘油一酯、二酯和三酯。此外，在甘油二酯和三酯之間還觀察到一個很大的斑點，經(jīng)驗證是脂肪酸甲酯。

3.2 TLC-THM-GC 方法學(xué)考察

將薄板上含甘油酯的斑點刮下，經(jīng)溶劑提取后用 THM-GC 測定。高溫下甘油酯在過量 TMSH 存在下發(fā)生水解甲基化反應(yīng)生成脂肪酸甲酯，GC 測定生成的脂肪酸甲酯，進(jìn)而確定甘油酯的含量。由于以植物油為原料的生物柴油中的甘油酯主要包含硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸，取含上述脂肪酸的甘油酯標(biāo)樣，對 TLC-THM-GC 法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、重現(xiàn)性等進(jìn)行了考察。歐盟規(guī)定生物柴油中甘油一酯，二酯，三酯的含量分別不高于0.8%，0.2% 和 0.2% （w/w） ［12］，根據(jù)生物柴油密度［12］ （0.86～0.90 g/mL，取 0.87 g/mL計算） 轉(zhuǎn)換成質(zhì)量體積濃度，經(jīng)5倍稀釋后其相應(yīng)的限量分別為1402，348和348 mg/L。各甘油酯在60～2000 mg/L的濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，r2為0.9863～0.9993，線性范圍的下限小于歐盟規(guī)定的最大限量（表1）。對250 mg/L甘油二酯平行測定5次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%～7.2%，表明方法的重現(xiàn)性良好。上述結(jié)果表明，TLC-THM-GC法適合測定生物柴油中的甘油酯。

3.3 生物柴油樣品分析

樣品按照2.3節(jié)實驗步驟分析，各類型脂肪酸甲酯通過保留時間和質(zhì)譜解析定性，按照2.4節(jié)定量方法計算甘油酯含量。各甘油酯中脂肪酸的組成（即相對百分含量）用歸一化法定量 （各脂肪酸的峰面積除以該甘油酯中脂肪酸面積的總和）。

生物柴油樣品經(jīng) TLC 分離后得到的各甘油酯的 THM-GC 色譜圖（圖2）。生物柴油樣品中各甘油酯的含量及其脂肪酸的相對百分含量見表2。從圖2及表2可見，兩種生物柴油中均檢測到殘余的甘油一酯、二酯、三酯，而甘油酯中的脂肪酸有 C16∶0 和 C18∶0，C18∶1，C18∶2 這4種組分。菜籽油中主要是 C18∶1 為主，在各甘油酯中其相對百分含量都大于73%。而棕櫚油中C16∶0 含量最多，在各甘油酯中其相對百分含量都超過50 %。

Fig．2 Typical chromatograms obtained by thermally assisted hydrolysis and methylation- gas chromatography for residual glycerides in biodiesel samples made by rap oil （a） and palm oil （b） after TLC separation

1. 棕櫚酸甲酯; 2. 硬脂酸甲酯; 3. 油酸甲酯; 4. 亞油酸甲酯。 1. Methyl palmitate; 2. Methyl stearate; 3. Methyl oleate; 4. Methyl linoleate.

表2還表明，兩種生物柴油中甘油一酯與甘油三酯的含量均低于歐盟規(guī)定的 7008和 1740 mg/L，而甘油二酯的含量皆超過了歐盟規(guī)定的 1740 mg/L，分別為 2035和 2601 mg/L。

References

1 CHENG Bei-Jiu （程備久）. Biomass Study （生物質(zhì)能學(xué)）. Beijing （北京） : Chemical Idustru Press （化學(xué)工業(yè)出版社）， 2008: 176～180

2 LI Chang-Xiu， YANG Hai-Ying， WANG Li-Qin， TIAN Song-Bai （李長秀， 楊海鷹， 王麗琴， 田松柏）. Chinese Journal of Chromatography （色譜）， 2006， 32（7） : 524～528

3 Freedman B， Kwolek W F， Pryde E H. J. Am. Oil Chem. Soc.， 1986， 63（10） : 1370～1375

4 ZENG Jian-Li， WANG Xiao-Dong， ZHAO Bing， WANG Yu-Chun （曾建立， 王曉東， 趙 兵， 王玉春）. China Oils and Fats（中國油脂）， 2007， 32（7） : 66～69

5 Plank C， Lorbeer E. J. Chromatogr. A， 1995， 697（1-2）: 461～468

6 LI Chang-Xiu， TANG Zhong， YANG Hai-Ying （李長秀， 唐 忠， 楊海鷹）. Journal of Instrumental Analysis（分析測試學(xué)報）， 2005， 24（5） : 66～68

7 Foglia T A， Jones K C， Nuez A， Phillips J G， Mittelbach M. Chromatographia， 2004， 60（5-6）: 305～311

8 Marcat B， Cecchin G. J. Chromatogra. A， 1996， 730（1-2）: 83～90

9 Freedman B， Pryde E H， Kwolek W F. J. Am. Oil Chem. Soc．， 1984， 61（7） : 1215～1220

10 Ishida Y， Katagiri M， Ohtani H. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（15）: 3296～3299

11 Fontana J D， Zagonel G， Vechiatto W W， Costa B J， Laurindo J C， Fontana R， Pelisson L， Jorge B H， Lancas F M. J. Chromatogra. Sci， 2009， 47（9）: 844～846

12 Automotive Fuels-Fatty Acid Methyl Esters （FAME） for Diesel Engines-Requirements and Test Methods. European Standard EN 14214-2008

Determination of Glycerides in Biodiesel by Thin Layer

Chromatography-Thermally Assisted Hydrolysis and

Methylation-gas Chromatography

WANG Peng， SUN Yang， LIU Ze-Yi， FU Yu-Fei， PAN Zai-Fa， WANG Li-Li*

（College of Chemical Engineering and Materials Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014）

Abstract A method was developed for the determination of residual glycerides in biodiesel on the basis of thin layer chromatography-thermally assisted hydrolysis and methylation-gas chromatography （TLC-THM-GC） using a pyrolysis-GC system. With the THM in the presence of an organic alkali， trimethylsulfonium hydroxide （TMSH）， glycerides were converted into their corresponding fatty acid methyl esters. Thus， residual glycerides could be determined well by the total peak area of fatty acid methyl esters formed. Glycerides in samples were separated by TLC， and then were extracted. The results showed that by adding 3

L TMSH （0.1 mol/L） methanol solution to 3

L extract of sample and methylating the mixture at 350 ℃， the glycerides would be sensitively determined. The calibration curves of monoglyceride， diglyceride and triglyceride exhibited good linearity with the regression coefficients from 0.9863 to 0.9993 at the concentration ranged from 60 to 2000 mg/L. The reproducibility was fairly good with the RSD （n＝5） from 3.2% to 7.2% for four kinds of diglycerides at 250 mg/L concentration level. The potential of the proposed method was assessed by applying it to the determination of residual glyceride in biodiesel. The results prove this TLC-THM-GC technique is an accurate and sensitive method for determining residual glyceride in biodiesel samples.

Keywords Thin layer chromatography; Thermally assisted hydrolysis and methylation; Gas chromatography; Trimethylsulfonium hydroxide; Glyceride; Biodiesel

（Received 2 March 2011; accepted 6 May 2011）