超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析奶粉中9種雌激素

1 引 言

奶粉是人們生活中重要的食品之一，與人們的健康息息相關(guān)。由于近年來不斷發(fā)生的奶

粉安全事件，因此奶粉安全問題備受關(guān)注。雌激素作為內(nèi)分泌干擾物之一，有

研究表明兒童性早熟，男性前列腺癌，婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升與食品中雌激素的

殘留有關(guān)［1，2］。我國農(nóng)業(yè)部在2002年第193號(hào)公告里禁止性激素和具有雌激素樣作用的物質(zhì)在食品動(dòng)物中的使用。但是在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，違規(guī)濫用這類物質(zhì)的情況仍然很多［3］；同時(shí)有研究表明: 奶牛在養(yǎng)殖過程中，可能會(huì)引起牛奶中內(nèi)源性雌激素的升高［4］。因此，為保障食品的安全，內(nèi)源性和外源性雌激素的同時(shí)檢測(cè)就顯得很重要。

食品中雌激素常用的檢測(cè)方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［5，6］和液相色譜-

質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［7～12］。GC-MS雖然分離效果好，但是雌激素?fù)]發(fā)性低，需要衍生化，操作繁瑣。LC-MS因?yàn)殪`敏度高，選擇性好，樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單而成為雌激素檢測(cè)的主要方法［13］。超高效液相色譜（UPLC）相對(duì)LC分離效果好，分析速度快，非常適合于多組

分快速檢測(cè)［14］。飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）能夠進(jìn)行分子量的精確測(cè)定，適合復(fù)雜基質(zhì)中組分的準(zhǔn)確定性，因此UPLC-TOF-MS成為復(fù)雜基質(zhì)中多組分殘留的有效分析方法［15］。目前檢測(cè)的樣品多為牛奶［7～9］、動(dòng)物肌肉［5，7，10］、血液［11，12］和尿液［6］等，所采用的樣品處理方法大多操作復(fù)雜。本研究借鑒QuEChERS［16］方法中快速提取的部分原理，結(jié)合正己烷除脂及NH2柱凈化，建立了奶粉中9種雌激素的超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）檢測(cè)方法，并成功用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、SYNAPT G2高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters

公司）；2200T超聲波清洗器（上海安譜公司）； TGL-10B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭公司）；

KD200氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛公司）；NH2固相萃取柱（500 mg，3 mL）、中性氧化鋁固相

萃取柱（500 mg，3 mL）、12位固相萃取儀（德國CNW公司）。

乙腈、純水、乙酸乙酯、甲醇（LC-MS級(jí)，美國Fisher公司）； NaCl（優(yōu)級(jí)純，上海

國藥集團(tuán)）; 雌三醇、氘代β-雌二醇、β-雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌甾酮、17α-乙炔雌二醇、

雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚（純度大于97.8%，美國Sigma公司）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液: 分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于－20℃保存；用乙腈-水（10∶90，V/V）稀釋，得到1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級(jí)稀釋得到所需濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.8

m）；流動(dòng)相: 水（A）和乙

腈（B）；梯度洗脫程序: 0～2 min， 5%～35% B; 2～8 min， 35%～45% B，8～8.5 min， 45%～95% B; 8.5～11.0 min，95% B; 11.0～11.5 min， 95%～5% B; 11.5～13.0 min， 5% B。流速: 0.7 mL/min；柱溫: 40 ℃；樣品室溫度: 10 ℃；進(jìn)樣量: 10

L。

ESI負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓2.8 kV；錐孔電壓: 45 V；提取錐電壓: 4 V；離子源溫度:

120 ℃；脫溶劑氣溫度: 450 ℃；錐孔氣流量: 40 L/h；脫溶劑氣流量: 1000 L/h；碰撞氣:

氬氣；質(zhì)量范圍: 100～800 Da; 掃描時(shí)間: 0.2 s; MSe模式中各雌激素碰撞電壓見表1，其它

參數(shù)同MS模式。

2.3 樣品處理

稱取混勻的奶粉樣品2.0 g于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL純水，充分混勻，

超聲波提取10 min后，加入20 mL乙腈，振搖2 min，再次超聲波提取10 min，然后加入3 g NaCl，振搖2 min，以7000 r/min離心10 min，取10 mL上清液于10 mL離心管中；在45 ℃以微氮?dú)饬鞔抵? mL，加入3 mL正己烷，振搖1 min后，靜置5 min，去除上層正己烷，重復(fù)操作1次。下層乙腈提取液用微氮?dú)饬鞔抵两桑? mL乙酸乙酯-甲醇

（90∶10，V/V）溶解殘?jiān)齼艋＊?/p>

預(yù)先用8 mL乙酸乙酯-甲醇（90∶10，V/V）活化平衡NH2柱后，將上述待凈化液全部上柱，再用10 mL乙酸乙酯-甲醇（90∶10，V/V）洗脫，收集全部洗脫液于10 mL離心管中；用微氮?dú)饬鞔抵两桑尤?00

L甲醇，再吹至近干，用乙腈-水（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，漩渦混勻30 s，過0.2

m濾膜，濾液供分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取條件和除脂條件的優(yōu)化

QuEChERS的提取方法常用NaCl促使水與乙腈快速分層，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物的快速溶劑萃取［16］。本研究采用這種快速溶劑提取方法提取目標(biāo)化合物，并與乙腈直接超聲提取方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示: 前者對(duì)9種雌激素回收率在84%～102%之間，平均為93%； 而采用乙腈直接超聲提取的回收率在43%～57%之間，平均為47%。本研究采用快速溶劑提取方法進(jìn)行樣品提取。

分別考察了正己烷除脂-NH2柱凈化與氧化鋁柱直接除脂和凈化的效果。采用氧化鋁柱凈化時(shí)，上樣液和淋洗液均為正己烷-丙酮（70∶30，V/V），洗脫液為二氯甲烷-甲醇（50∶50，V/V）。結(jié)果表明: 前者對(duì)9種雌激素回收率在80%～97%之間，平均為87%； 而后者的回收率在22%～77%之間，平均為45%。因此，本研究采用正己烷除脂， NH2柱凈化。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了ACQUITY UPLC HSS T3和BEH C18色譜柱在不同溶劑系統(tǒng)，梯度洗脫和流速以及添加改性劑與否時(shí)的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，無論C18色譜柱還是T3色譜柱，在流動(dòng)相中添加10 mmol/L乙酸銨改性劑時(shí)，9種雌激素的靈敏度均降低1～3倍；C18色譜柱通

過變換乙腈-水和甲醇-水2種溶劑系統(tǒng)、改變洗脫梯度和流速均難以實(shí)現(xiàn)己烷雌酚和己二烯

雌酚，雌酮和乙炔雌二醇之間的基線分離；而T3色譜柱在流動(dòng)相為乙腈-水時(shí)，通過優(yōu)化洗

脫梯度和流速，在8 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)9種雌激素的基線分離，最小分離度為己烷雌酚與己二烯

雌酚之間的1.59，梯度洗脫程序共為13 min。優(yōu)化后的色譜條件見2.2節(jié)。

50

g/L 的9種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液基峰離子（BPI）色譜圖和奶粉樣品中加標(biāo)量為10

g/kg的各雌激素母離子提取色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 9種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的基峰離子色譜圖

Fig．1 Base-peak ion （BPI） chromatograms of a mixed standard solution of nine estrogens

1. 雌三醇（Estriol）; 2. β-雌二醇（β-Estradiol）; 3. α-雌二醇（α-Estradiol）; 4. 馬烯雌甾酮（Equilin）; 5. 17α-乙炔雌二醇17（α-Ethinylestradiol）; 6. 雌酮（Estrone）; 7. 己烯雌酚（Diethylstilbestrol）; 8. 己二烯雌酚（Dienestrol）; 9. 己烷雌酚（Hexestrol）。

圖2 加標(biāo)樣品中9種雌激素和內(nèi)標(biāo)物（氘代β-雌二醇）的母離子提取色譜圖

Fig．2 Extracted parent ion chromatograms of nine estrogens and internal standard （β-estradiol-d3） in the spiked milk sample

1. 雌三醇（Estriol）; 2.β-雌二醇（β-Estradiol）; 3.α-雌二醇α-Estradiol；4. 馬烯雌甾酮（Equilin）; 5.17α-乙炔雌二醇（17α-Ethinylestradiol）； 6. 雌酮（Estrone）； 7. 己烯雌酚（Diethylstilbestrol）; 8. 己二烯雌酚（Dienestrol）; 9. 己烷雌酚（Hexestrol）; 10. 氘代β-雌二醇 （β-estradiol-d3）。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用乙腈-水（50∶50，V/V）配制0.1 mg/L的9種雌激素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射

泵以20

L/min流速直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。為得到待測(cè)雌激素最佳的離子化效率和MSe模式

下適宜的裂解質(zhì)譜圖，采用單因素變化模型逐個(gè)對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電壓、錐

孔電壓、源溫度、脫溶劑溫度和脫溶劑氣流量對(duì)離子化效率影響較大，同時(shí)對(duì)碰撞電壓進(jìn)行

優(yōu)化，結(jié)果見表1。

3.5 線性范圍和檢出限

用經(jīng)檢測(cè)的9種雌激素含量均低于檢出限的奶粉作為基質(zhì)樣品，按2.3節(jié)所述樣品前處理方法得到樣品處理液。將該處理液配制成濃度分別為0.001， 0.002， 0.005， 0.01， 0.05， 0.1和0.5 mg/L的系列混合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，各濃度點(diǎn)內(nèi)標(biāo)（β-雌二醇-d3）濃度均為0.01 mg/L。以各雌激素母離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)β-雌二醇-d3母離子色譜峰面積之比乘以β-雌二醇-d3的質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)，各雌激素的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的樣品中雌激素濃度作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的樣品中雌激素濃度為定量限（LOQ），獲得各雌激素的檢出限和定量限。由表3可見，各雌激素在0.001～0.5 mg/L 范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，檢出限為0.11～0.30

g/kg，定量限為0.37～1.0

g/kg。

3.6 方法的回收率與精密度

在奶粉中添加不同濃度水平（1， 2， 10和100

g/kg）的雌激素，每個(gè)水平重復(fù)5次，用基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法測(cè)定回收率和精密度，結(jié)果見表4。由表4可見，回收率為61%～137%； 精密

度RSD為1.0%～22.6%。

3.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本方法對(duì)購自超市的4個(gè)不同品牌的7份奶粉樣品（適用對(duì)象為0～3歲的嬰兒和幼兒）進(jìn)行分析，均未檢出上述9種雌激素。

3.8 小結(jié)

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS方法分析了奶粉中9種不同性質(zhì)雌激素殘留，實(shí)現(xiàn)了9種雌激素的快速基線分離，質(zhì)譜母離子和特征性子離子的精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定，增強(qiáng)了本方法在

復(fù)雜基質(zhì)中雌激素的定性能力，結(jié)合準(zhǔn)確的基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法定量，能夠滿足奶粉樣品中雌激素多殘留快速分析的要求。

References

1 Okamotoa Y， Liua X， Suzukia N. Toxicology Letters， 2010， 193（3）: 224～228

2 Aksglaede L， Juul A， Leffers H， Skakkebk N E， Andersson A. Hum. Reprod. Update， 2006， 12（4）: 341～349 

3 WU Ping-Gu， WANG Qiang， CHEN Hui-Hua， YING Yong-Fei， ZHAO Yong-Xin， SHEN Xiang-Hong， SONG Guo-Liang， XU Xiao-Min（吳平谷，王 強(qiáng)，陳慧華，應(yīng)永飛，趙永信，沈向紅，宋國良，徐小民）. Chinese J. Anal. Chem. （分析化學(xué)）， 2008， 36（11）: 1476～1482

4 Ganmaa D， Sato A. Med. Hypotheses， 2005， 5（6）: 1028～1037

5 Seo J， Kim H Y， Chung B C， Hong J. J. Chromatogr. A， 2005， 1067（1-2）: 303～309

6 ZHAN Jia， YU Xue-Jun， LI Zuo-Qing， XIE Dong-Hua， HAUNG Shao-Tang， FAN Yuan-Mu， CHEN

Shu-Bing， PENG Jin-Feng（湛 嘉，俞雪鈞，李佐卿，謝東華，黃紹棠，樊苑牧，陳樹兵，彭錦峰）. Chinese

J. Anal. Chem. （分析化學(xué)）， 2009， 37（2）: 251～254 

7 Yang Y， Shao B， Zhang J. Wu Y， Duan H. J. Chromatogr. B， 2009， 877（5-6）: 489～496

8 Tso J， Aga D S. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（29）: 4784～4795

9 Yan W， Li Y， Zhao L， Lin J M. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（44）: 7539～7545

10 CHEN Hui-Hua， YING Yong-Fei， WU Ping-Gu， Wei Min-Jue， ZHU Cong-Ying， QU Jian， CHEN Man-Qian（陳慧華，應(yīng)永飛，吳平谷，韋敏玨，朱聰英，屈 健，陳熳茜）. Chinese J. Anal. Chem. （分析化學(xué)）， 2009， 37（2）: 181～186

11 Hosogi J， Tanaka H， Fujita K， Kuwabara T， Ikegawa S， Kobayashi N， Mano N， Goto J. J. Chromatogr. B， 2010， 878（2）: 222～227

12 Draisci R， Palleschi L， Ferretti E， Marchiafava C， Lucentini L， Cammarata P. Analyst， 1998， 123（12）: 2605～2609

13 YAN Wei， LIN Jin-Ming（嚴(yán) 煒，林金明）. Chinese J. Anal. Chem. （分析化學(xué)）， 2010， 38（4）: 598～606

14 Guillarme D， Schappler J， Rudaz S， Veuthey J . Trends Anal. Chem.， 2010， 29（1）: 15～27

15 Lacina O， Urbanova J， Poustka J， Hajslova J . J. Chromatogr. A，  2010， 217（5）: 648～659

16 Anastassiades M， Lehotay S J， Stajnbaher D， Schenck F J. J. AOAC Int.， 2003， 86（2）: 412～431

Simultaneous Analysis of Nine Estrogens in Milk Powder with

Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled

Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

WANG He-Xing， ZHOU Ying*， JIANG Qing-Wu

（Key Laboratory of Public Health Safety of Ministry of Education， College of Public Health，

Fudan University， Shanghai 200032）



Abstract A rapid， sensitive and specific method has been developed for the

simultaneous analysis of 9 estrogens including estradiol， β-estradiol， α-estradiol，

equilin， 17α-ethinylestradiol， estrone， diethylstilbestrol， dienestrol and hexestrol using

ultra-performance liquid chromatography coupled quadrupole time-of-flight mass

spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS）with electrospray ionization （ESI） in negative mode.

The milk powder was dissolved in water， the estrogens were extracted with

acetonitrile using ultra-sonication and the lipids in extract solution were removed by

n-hexane liquid-liquid extraction. Then the estrogens were purified by the NH2 solid

phase extraction cartridge， separated on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column

（100 mm×2.1 mm×1.8

m） and analyzed qualitatively and quantitatively by

UPLC-Q-TOF in MS and MSe mode. The overall analysis time of the method was 13

min and the linear range was 0.001 to 0.5 mg/L. The limits of detection （LOD） for the

compounds were from 0.11 to 0.30

g/kg and the limits of quantification （LOQ） were

in the range of 0.37－1.0

g/kg. The mass errors between theoretical and experimental

masses obtained for deprotonated molecules of 9 estrogens and internal standard

（β-estradiol-d3） were between －1.0 and 0.9 mDa. At the spiked levels of 1， 2， 10， 100

g/kg， the average recoveries were 61%－137% with the relative standard deviations

of 1.0%－22.6%. The results showed that this method is suitable to the multi-residue

detection of estrogens in milk powder. It has been applied to the analysis of seven real milk powder samples， and the target estrogens were not found.

Keywords Ultra performance liquid chromatography coupled quadrupole time-of-flight mass spectrometry; Estrogens; Milk powder

（Received 29 November 2010; accepted 8 June 2011）