超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉和土壤中丁醚脲及其代謝物的殘留

摘 要 建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時快速測定茶葉和土壤中丁醚脲及其代謝物殘留量的方法。樣品采用乙腈提取，加入乙酸銨和NaCl進行液液分配，PSA結合GCB進行固相分散萃取除雜質，Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7

m）分離，超高效液相色譜-串聯質譜法測定。在2.0～4000

g/L濃度范圍內，不同基質中丁醚脲均有較好的線性關系（r ＞0.99），檢出限為0.5

g/L；在2.0～2000

g/L濃度范圍內，不同基質中丁醚脲-脲均有較好的線性關系（r ＞0.99），檢出限為0.2

g/L。在0.02、0.20和4.00 mg/kg添加水平下，除綠茶中的低濃度水平丁醚脲回收率較低（56.3%，64.1%）外，其余均介于70.８%～110.5%之間，相對標準偏差介于0.８%～14.4%之間，方法定量限為丁醚脲0.005 mg/kg、丁醚脲-脲0.002 mg/kg。利用本方法對丁醚脲在茶園田間殘留實驗樣品進行測定，獲得了較好的效果，方法快速、簡單，能夠滿足殘留檢測的需要。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜； 茶葉； 丁醚脲及其代謝物

2010-11-27收稿；2011-04-04接受

本文系農業部茶及飲料植物產品加工與質量控制重點開放實驗室項目（No. 2010K1006）、浙江省自然科學基金項目（No. Y3100259）和農業部農藥檢定所農藥殘留田間登記試驗項目（No. 2009P593）資助

* E-mail: chenzm@mail.tricaas.com

1 引 言

丁醚脲（1-Tert-butyl-3-（2，6-diisopropyl-4-phenoxyphenyl）thiourea）是一種硫脲類化合物選擇性殺蟲和殺螨劑，具有內吸和熏蒸作用，廣泛用于棉花、水果、蔬菜和茶樹上，在紫外光下轉變為具殺蟲活性的物質丁醚脲-酰胺體（Tert-butyl-（2，6-diisopropyl-4-phenoxyphenyl）-carbodiimide），對氨基甲酸酯、有機磷和擬除蟲菊酯類農藥產生抗性的蚜蟲、葉蟬、粉虱、蛾和螨類具有很好的殺滅效果。丁醚脲在光解、水解、環境微生物降解以及植物體內降解的主要產物為丁醚脲-酰胺體、丁醚脲-脲（1-Tert-butyl-3-（2，6-diisopropyl-4-phenoxyphenyl） -urea）等。最新研究表明，丁醚脲對蜜蜂具有一定毒性，丁醚脲代謝物比丁醚脲原藥本身具有更高的毒性，因此2002年歐盟頒布的第2076/2002號法規規定對丁醚脲實行本地區內禁用、禁售。

目前，日本、澳大利亞等國家對茶葉中丁醚脲及其兩種代謝物的最大殘留限量總值定為20 mg/kg，但是歐盟、美國等則規定不得檢出；有關茶葉、土壤等樣品中丁醚脲及其代謝物同時測定方法的未見報道。因此，有必要研究茶葉、土壤樣品中丁醚脲及其代謝物殘留的分析方法，滿足食品和環境安全監控需要，保障茶葉飲用安全和環境安全。

超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定，結合基質固相分散萃取技術凈化，是一種同時具備高效率、高特異性和高靈敏度的普適性方法，廣泛用于農藥及環境污染物殘留分析測定中。本研究通過向茶葉等樣品中加入乙腈進行萃取，加入乙酸銨和NaCl進行液液分配，離心，乙腈層進行PSA和GCB分散固相萃取除雜質，采用超高效液相色譜-串聯質譜基質外標法測定，建立了茶葉、土壤等基質中丁醚脲及其代謝物殘留量同時測定方法，本方法快速、簡便、可靠，能滿足殘留監控的需要。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UPLC/Quattra Premier XE超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀，配有電噴霧電離（ESI）源，MassLynx 4.1質譜工作站軟件（美國Waters公司）；高速離心機（德國Sigma公司）；0.22

m Filter Unit濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）；高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk公司）；乙酸銨、NaCl、無水MgSO4（分析純，上海四赫維化工有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、強陽離子（SCX）、C18封端、C18-N不封端、氨基（NH2）填料（天津博納艾杰爾科技有限公司）；STH-2型石墨化炭黑（GCB，100～150目（0.15～0.76 mm粒徑），吉林吉炭集團研究所）。丁醚脲和丁醚脲-脲標準品（99.0%，日本和光純藥WAKO工業株式會社）。

10 mmol/L乙酸銨溶液: 稱取0.78 g乙酸銨，用純凈水溶解并定容至1000 mL，當天配制現用。

2.2 色譜-質譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7

m）；柱溫: 40 ℃；進樣量: 5

L；樣品室溫度: 8 ℃；采用10 mmol乙酸銨溶液（A）和甲醇（B）組成的流動相進行梯度洗脫，洗脫程序: 0～6.0 min，30%～1.0% A；6.0→8.0 min， 1.0%～0.0% A；8.0～9.8 min，0.0% A；9.8～10.2 min，0.0%～30% A，保持1.8 min。

電噴霧電離正離子模式，ESI＋；多反應監測掃描（MRM）；電噴霧電壓: 2.0 kV；離子源溫度: 120 ℃；脫溶劑氣溫度: 300 ℃；錐孔反吹氣流量: N2，50 L/h；脫溶劑氣流量: N2，500 L/h；碰撞氣: Ar，0.15 mL/min；倍增電壓: 650 V；二級質譜母離子駐留時間: 0.400 s。其它參數見表1。

2.3 樣品處理

取茶葉鮮葉（或成茶綠茶、紅茶、土壤）樣品約500 g，放入粉碎機中磨碎，制備供分析樣品。稱取2.00 g樣品至50 mL離心管，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，過夜避光浸泡。再加入乙酸銨和NaCl各0.5 g，渦旋振蕩混勻，以8000 r/min離心4 min，將6 mL上層提取液放入裝有PSA， GCB和無水MgSO4的10 mL離心管中，渦旋混勻1 min，使填料充分吸附雜質，以8000 r/min離心4 min，取上清液過0.22

m 濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

2.4 標準溶液配制與標準曲線

分別稱取0.0100 g丁醚脲和丁醚脲-脲標準品至燒杯中，乙腈溶解并轉移到50 mL容量瓶，定容； 分別配制成200 mg/L標準儲備液。為避免丁醚脲分解，采用棕色容量瓶或鋁箔包裹，－20 ℃下避光保存。

將丁醚脲儲備液用乙腈稀釋成4000， 1000， 400， 100， 40， 10和2.0

g/L的系列標準溶液；將丁醚脲-脲儲備液用乙腈稀釋成2000， 500， 200， 50， 20， 5.0和2.0

g/L的系列標準溶液；同時采用空白茶葉鮮葉（或成茶綠茶、紅茶、土壤）提取凈化液稀釋儲備液，配制成相應的基質標準溶液，獲得丁醚脲、丁醚脲-脲的溶劑/基質標準曲線和線性相關系數及儀器檢出限。

2.5 添加回收率與精密度

稱取經測定不含丁醚脲及其代謝物的茶葉鮮葉（或成茶綠茶、紅茶、土壤）空白樣品2.00 g，分別添加20， 2和0.2

g/L的丁醚脲（或丁醚脲-脲）標準溶液0.40， 0.20和0.20 mL，使其相當于4.00， 0.20和0.02 mg/kg 濃度添加水平，混勻后，立即按照2.3節 加入乙腈溶劑進行處理提取與凈化，每個濃度水平重復5次；移取相當量的丁醚脲（或丁醚脲-脲）標準溶液至進樣小瓶中，加入按照2.3節后的空白茶葉鮮葉（或成茶綠茶、紅茶、土壤）樣品溶液稀釋定容，作為基質標準進行測定，計算添加回收率、相對標準偏差及檢出限。

3 結果與討論

3.1 質譜條件優化

采用ESI＋或ESI－模式電離測定丁醚脲均有報道。本研究對丁醚脲及其代謝物分別進行ESI＋和ESI－模式監測，對比發現，此類化合物在ESI＋模式下有更好的響應，故選擇ESI＋模式電離測定。

選擇準分子離子峰\\＋作為母離子，進行二級質譜分析，丁醚脲（B）及其代謝物（C， D）的二級質譜圖見圖1。不斷增加二級碰撞能量，子離子碎片逐漸增多，圖2給出了丁醚脲準分子離子峰\\＋ m/z 385.3 在不同碰撞能量下的二級質譜圖，m/z 385.3碰撞裂解后生成子離子m/z 329.2，312.2，287.1，278.2，270.1，253.1和236.1，分別代表失去H2C＝C（CH3）2、H2C＝CHCH3、NH3和H2S等中性分子。

丁醚脲-脲準分子離子峰\\＋ m/z 369.30在二級碰撞能量裂解下，生成子離子m/z 313.2，271.1，229.1和212.1，分別代表失去H2C＝C（CH3）2，H2C＝CHCH3，H2C＝CHCH3和NH3。丁醚脲-甲酰胺體準分子離子峰\\＋ m/z 353.3在進一步二級碰撞裂解下，生成子離子m/z 297.2，280.2及253.2，可能分別為丟失H2C＝CHCH3，NH3和HCN。

文獻\\報道，丁醚脲的一級光解或微生物降解代謝物為活性物質A丁醚脲-酰胺體，然后再降解成C丁醚脲-脲。但在本研究中，利用質譜全掃描及特征離子掃描對田間殘留實驗樣品的分析未檢出A，而發現其雙鍵加氫化合物D丁醚脲-甲酰胺體。D相對于B丁醚脲的相對保留時間與文獻\\報道的不一致，推測可能因為A在環境中已經加氫轉變， 或在前處理中加氫轉化成D，以及降解成C，因此未檢出A。由于A和D兩種化合物均未購買到標準品，無法進一步進行準確定量分析。表1中所列的丁醚脲-甲酰胺體的MS/MS條件也是建立在對實際殘留樣本中的疑似此化合物D色譜峰提取離子m/z 353.3進行二級質譜裂解所獲得。通過對電噴霧電壓、錐孔電壓和碰撞能量等條件的優化，獲得丁醚脲及其代謝物的定性、定量離子對及碰撞能量等最佳參數（表1）。運行過程中采用柱后閥切換模式進樣質譜，有助于降低對離子源的污染。

3.2 液相色譜條件優化

對丁醚脲原藥成分的分析測定多采用等度洗脫，并可知在C18色譜柱中，丁醚脲屬于具有較強保留的化合物。本研究發現，丁醚脲在C18柱中保留較強，代謝物丁醚脲-脲次之，丁醚脲-甲酰胺體保留最弱，而茶葉中富含咖啡堿、色素等不同極性的雜質化合物，容易干擾目標化合物分析，因此為保證獲得較好的分離度，本方法通過對比，最終選擇甲醇和10 mmol/L乙酸銨作為流動相，采用梯度洗脫的方法提高分離效果，降低基質中的雜質干擾，盡量減少質譜離子化時的基質效應。采取2.2節的梯度程序洗脫，在0～6 min內，通過不斷線性增加流動相中甲醇的比例，利用質譜全掃描離子監測，依次洗脫出色素、咖啡堿、丁醚脲-甲酰胺體、丁醚脲-脲和丁醚脲等；進一步提高甲醇的比例，有助于洗脫樣品中保留較強的雜質，降低雜質對色譜柱的污染。

圖1 丁醚脲-酰胺（A）、丁醚脲（B）、丁醚脲-脲（C）和丁醚脲-甲酰胺（D）的結構式及二級質譜圖

Fig．1 Structures and MS/MS spectrum of diafenthiuron-carbodiimide （A）， diafenthiuron （B） and its metabolites diafenthiuron-urea （C）， diafenthiuron-methanimidamide （D）

圖2 丁醚脲的準分子離子峰\\＋m/z 385.3 在不同碰撞能量下的二級質譜圖

Fig．2 MS/MS spectrum of \\＋m/z 385.3 from diafenthiuron in different collision energy

圖3給出了綠茶基質標準溶液的丁醚脲（A1）及丁醚脲-脲（A2）、空白土壤溶液的丁醚脲（B1）及丁醚脲-脲（B2）、空白綠茶樣品溶液的丁醚脲（B3）、綠茶實際樣品的丁醚脲（C1）和丁醚脲-脲（C2）和丁醚脲-甲酰胺（C3）的二級質譜總離子流色譜圖，從中可見丁醚脲及其代謝物得到較好分離，且無背景干擾。

3.3 樣品處理凈化條件優化

丁醚脲及其代謝物均溶于極性有機溶劑，乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷均為良好的提取劑。考慮到流動相的條件及后續凈化， 本研究選取對土壤、動植物試樣均具有較好提取率的乙腈作為提取劑，提取出的色素、油脂類雜質較少，且能夠沉淀蛋白質等雜質； 加入NaCl鹽析， 使乙腈與樣品中的水質分層； 加入適量乙酸銨， 有助于提高丁醚脲在水溶液中的穩定性。

茶葉中富含大量雜質，可采用固相萃取柱或凝膠滲透色譜（GPC）凈化，但由于丁醚脲的光不穩定性，前處理長時間暴露于光照下，會導致回收率降低。因此簡單、快速的前處理凈化方法有助于更準確地獲得樣品中丁醚脲及其代謝物的實際殘留量。QuEChERS方法中的基質固相分散技術是近年來國際上興起的快速、高效的農藥殘留檢測前處理技術，具有簡單、快速、方便的優點，常采用的固相分散萃取劑主要有PSA、C18和GCB等，PSA能有效去除樣本中的脂肪酸、糖類物質等極性基質雜質，C18能去除部分非極性脂肪和脂溶性雜質，GCB能去除色素和固醇類雜質。

圖3 綠茶基質標準溶液中的丁醚脲（A1）及丁醚脲-脲（A2）、空白土壤溶液中的丁醚脲（B1）及丁醚脲-脲（B2）、空白綠茶樣品溶液中的丁醚脲（B3）、綠茶實際樣品中的丁醚脲（C1）、丁醚脲-脲（C2）和丁醚脲-甲酰胺（C3）的二級質譜總離子流色譜圖

Fig． 3 MS/MS total ions chromatogram of diafenthiuron （A1） and diafenthiuron-urea （A2） in matrix standard solution of green tea; diafenthiuron （B1） and diafenthiuron-urea （B2） in soil blank solution; diafenthiuron （C1） ， diafenthiuron-urea （C2） and diafenthiuron-methanimidamide （C3） in real green tea sample

本研究以丁醚脲為例，分別在1 mL乙腈或1 mL正己烷作溶劑的200

g/L標準溶液中，對比了加入0.10 g不同吸附劑（GCB， NH2， PSA， C18-N和SCX）的吸附效果，溶液中殘留量測定結果見圖4。結果表明， 在乙腈溶液中，GCB對丁醚脲吸附最大，為25.10%；C18-N和SCX次之，分別為6.73%和6.75%，NH2和PSA的吸附最小，僅為2.27%和5.08%；而在正己烷溶液中，GCB對丁醚脲吸附最小，為63.16%，C18-N和NH2次之，分別為91.79%和93.49%，SCX和PSA的吸附最大，分別為97.78%和96.18%；GCB和C18-N雖然會帶入紫外下可觀測的大雜峰，但GCB能有效去除實際樣品基質色素干擾。

圖4 0.10 g不同類型填料對乙腈、正己烷中的丁醚脲吸附回收率效果

Fig．4 Recoveries of diafenthiuron after adsorbed by different kinds of adsorbents of 0.10 g in acetonitrile and hexane

1. 乙腈 （Acetonitrile）; 2. 正己烷 （Hexane）\\.



考慮到茶葉鮮葉、干茶及土壤的實際情況，選擇適量GCB和PSA作為固相分散萃取劑，并加入適量無水MgSO4進一步去除提取液中的水分。對不同的樣品基質，選擇不同量的填料配比進行優化，最終發現對于6 mL各種基質提取液分別采取下列配比，鮮葉: 0.30 g PSA＋0.20 g MgSO4＋0.050 g GCB；干茶: 0.30 g PSA＋0.10 g MgSO4＋0.050 g GCB；土壤: 0.10 g PSA＋0.10 g MgSO4＋0.010 g GCB，既能除去大部分雜質，又能滿足回收率要求。2 g樣品僅需10 mL乙腈，節省了有機溶劑，降低了污染。

3.4 線性方程、檢出限、回收率和精密度

在不同基質中，丁醚脲濃度在2.0～4000

g/L范圍內，丁醚脲-脲濃度在2.0～2000

g/L范圍內，以溶液濃度為橫坐標X，定量子離子對的提取離子色譜峰面積為縱坐標Y，獲得的相關線性方程見表2，相關系數基本大于0.99。根據信噪比S/N＝3計算，檢出限分別為0.5和0.2

g/L。丁醚脲-脲在乙腈溶劑和綠茶基質中的標準曲線更符合二次曲線。丁醚脲和丁醚脲-脲在鮮葉、土壤基質中表現出一定的基質減弱效應。因此，在測定時，為保證結果準確，采用基質標準進行定量分析。

在0.020， 0.200和4.00 mg/kg添加水平下，不同樣品中丁醚脲和丁醚脲-脲的回收率見表3，除成茶綠茶中的丁醚脲低濃度水平回收率較低（56.3%和64.1%）以外，其余均介于70.8%～110.5%之間，相對標準偏差介于0.8%～14.4%之間，方法定量限分別為0.005和0.002 mg/kg。

研究發現，在鮮葉等含水量較多的樣品中，由于水分的存在，添加入標準溶液后，應盡快加入乙腈進行提取，否則會降低丁醚脲的回收率，此結果與文獻\\吻合。未加入乙腈前，添加樣品放置時間越長，經質譜監測發現降解生成的丁醚脲-甲酰胺和丁醚脲-脲越多，從而導致丁醚脲原成分的回收率越低。添加0.200 mg/kg丁醚脲的茶葉鮮葉樣品，分別放置0， 30和120 min后，再加入乙腈提取，回收率分別為75.5%， 35.8%和15.7%；而立即加入足量的乙腈，混勻后再放置提取，對回收率影響不大，能滿足需要，可能是因為某些能降解丁醚脲的活性物質在大量有機溶劑存在時被抑制。 同時發現，丁醚脲在干茶紅茶中的回收率要遠大于綠茶，推斷可能是紅茶經過發酵后，損失了其降解丁醚脲的活性物質;在綠茶中，這些物質還能表現出活性，降解了丁醚脲，導致回收率低。

3.5 實際樣品測定

應用本方法于丁醚脲田間殘留實驗的茶葉、土壤實際樣品丁醚脲及其代謝物殘留檢測中。使用18%聯苯菊酯#8226;丁醚脲微乳劑（含丁醚脲15%）， 按推薦高劑量（丁醚脲有效成分10 g/畝， １畝＝667 m2）的1.5倍施藥，每畝兌水60 L，施藥間隔期為7 d，噴藥1～2次，分別于2009年10月在杭州茶園和2010年6月在紹興茶園進行實驗。噴灑1次后，間隔3， 5， 7和14 d后采集茶鮮葉進行測定。鮮葉中丁醚脲殘留量均小于0.050 mg/kg，丁醚脲-脲殘留量介于2.9～0.037 mg/kg之間。噴施2次后，間隔3， 5， 7和14 d后， 采集茶鮮葉和土壤樣品，將鮮葉烘干制成成茶進行測定，成茶中丁醚脲殘留量均小于0.0500 mg/kg，丁醚脲-脲殘留量介于9.5～0.17 mg/kg之間，茶園土壤中丁醚脲及丁醚脲-脲殘留量均小于0.005 mg/kg。

上述結果表明，本方法符合農藥殘留分析標準（RAQCG）的要求，可用于茶葉及土壤中丁醚脲及其代謝物丁醚脲-脲的快速檢測和確證分析。

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Determination of Diafenthiuron and Its Metabolites in Tea and Soil

by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray

Ionization Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xin-Zhong1，2，3， LUO Feng-Jian1， LIU Guang-Ming1， LOU Zheng-Yun1， CHEN Zong-Mao*1

1（Research Center of Quality Safety for Agricultural Products， Tea Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008）

2（Key Laboratory of Processing and Quality Control of Tea Beverage Plants Products，

Ministry of Agriculture， Hangzhou 310008）

3（Key Laboratory of Tea Processing Engineering of Zhejiang Province， Hangzhou 310008）

Abstract A rapid and convenient UPLC-MS/MS method for analysis of diafenthiuron and its metabolites in tea and soil has been developed and validated. The sample was extracted with acetonitrile， added ammonium acetate and sodium chlorid， after centrifugation， the upper solvent was cleaned-up by N-propylethyl-diamine （PSA） and graphitizing of carbon black （GCB）， then determined by UPLC-MS/MS coupled with Waters Acquity UPLC BEH C18 column （100 mm×2.1 mm×1.7

m）. Sample matrix-matched calibration was used to determine the residue contents by external standard. Over the concentration in the range of 2.0－4000

g/L （2.0－2000

g/L） for diafenthiuron （diafenthiuron-urea） in different matrix， the correlation coefficients （r） of the calibration curves were above 0.99， and the limits of detection （LODs） were 0.5

g/L （0.2

g/L） for each other. The recoveries of diafenthiuron and diafenthiuron-urea in fresh tea leaves， green tea， black tea and soil at three spiked concentration levels of 0.020， 0.200 and 4.00 mg/kg ranged from 70.8% to 110.5% with relative standard deviations （RSDs） between 0.8% and 14.4% （n＝5）， except for the recoveries of diafenthiuron in green tea at the lower level（56.3%， 64.1%）. The limits of quantitation （LOQs） of diafenthiuron and diafenthiuron-urea were 0.005 mg/kg and 0.002 mg/kg， respectively. For validated， this method has been applied to the determination of diafenthiuron and its metabolites in field treatment experimental samples with a good result.

Keywords Ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; Tea; Diafenthiuron and its metabolites

（Received 27 November 2010; accepted 24 April 2011）