微流控芯片上大腸桿菌的電化學(xué)阻抗檢測方法研究

摘 要 基于細(xì)菌懸浮液的阻抗特性和微流控芯片電化學(xué)阻抗檢測技術(shù)，采用所構(gòu)建的微流控芯片電化學(xué)阻抗分析系統(tǒng)，以大腸桿菌為樣本，優(yōu)化了擾動振幅、緩沖溶液電導(dǎo)率、掃描頻率和新制大腸桿菌標(biāo)本靜置時間等參數(shù)，對大腸桿菌標(biāo)本、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本進(jìn)行電化學(xué)阻抗檢測，建立了一種大腸桿菌快速定量檢測方法。在擾動振幅500 mV、緩沖溶液電導(dǎo)率為2.40

S/cm、掃描頻率范圍為100 Hz-1 MHz的條件下，大腸桿菌的測試范圍為7.43×105 ～1.49×108 CFU/mL，檢出限為7.43×104 CFU/mL。顯微測試表明，在該檢出限下，微流控芯片電化學(xué)阻抗分析系統(tǒng)對微管道檢測區(qū)域內(nèi)10個以上大腸桿菌就有明顯響應(yīng)。將所建立的方法應(yīng)用于某污水中細(xì)菌檢測，結(jié)果與國標(biāo)法基本一致。

關(guān)鍵詞 大腸桿菌； 微流控芯片； 微流控電化學(xué)阻抗分析系統(tǒng)； 定量檢測

1 引 言

細(xì)菌對人類生活有著巨大影響，細(xì)菌的快速、準(zhǔn)確檢測在環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測、微生物研究等方面具有重要意義。常規(guī)細(xì)菌檢測方法主要有培養(yǎng)法［1］、免疫學(xué)方法［2］、分子生物學(xué)方法［3］等，但存在耗時長、費用高、對設(shè)備、人員及環(huán)境等要求高的問題。近年來，以微機(jī)電加工（MEMS）為依托的微流控芯片分析技術(shù)為細(xì)菌檢測提供了新途徑。微流控芯片分析系統(tǒng)可以集成多種不同的操作單元，易于實現(xiàn)高通量的分析，便于實現(xiàn)系統(tǒng)微型化，樣品和試劑耗量極少，檢測手段更為豐富，在細(xì)菌分析檢測領(lǐng)域備受關(guān)注［4，5］。

微流控芯片分析系統(tǒng)的核心是芯片設(shè)計和檢測系統(tǒng)構(gòu)建。芯片的性能取決于電極結(jié)構(gòu)和管道結(jié)構(gòu)，其主要通過微管道內(nèi)電場和流場模擬分析進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計［6，7］。微流控芯片上細(xì)菌檢測方法主要有光學(xué)檢測法［8］和電化學(xué)檢測法［9］。光學(xué)檢測方法靈敏度高，但設(shè)備構(gòu)造復(fù)雜，微型化程度較低；而電化學(xué)檢測方法靈敏度高，體積小，裝置簡單，易于微型化。電化學(xué)檢測方法中阻抗檢測技術(shù)適用范圍廣，利用該技術(shù)對細(xì)菌懸浮液進(jìn)行定量分析主要有3種模式。一是通過細(xì)菌代謝活動進(jìn)行阻抗檢測， Rafael等［10］采用阻抗技術(shù)對不同培養(yǎng)基中活菌新陳代謝活動進(jìn)行監(jiān)測，為活菌檢測提供新途徑，但耗時長。二是利用細(xì)胞膜的電絕緣性進(jìn)行阻抗檢測， Suehiro等［11］采用阻抗檢測技術(shù)實現(xiàn)大腸桿菌的定量分析，但必須經(jīng)預(yù)處理使細(xì)菌吸附在電極表面。三是利用細(xì)胞內(nèi)液的高電導(dǎo)率進(jìn)行阻抗檢測， Suehiro等［12］將電穿孔（EP）與阻抗檢測相結(jié)合提高了對大腸桿菌的響應(yīng)靈敏度，但設(shè)備要求高。這些研究表明，微流控芯片電化學(xué)阻抗檢測方法可用于細(xì)菌檢測，但相關(guān)研究仍然處于起步階段，存在檢測時間長、過程復(fù)雜、實際樣本分析較少等問題。

基于微流控芯片上細(xì)菌阻抗檢測的3種模式［10～12］，依據(jù)微流控芯片分析原理和阻抗分析測試技術(shù)，本研究利用微電極周圍細(xì)菌懸浮液的阻抗特性進(jìn)行細(xì)菌分析與檢測，避免培養(yǎng)、吸附處理、高電場電穿透處理等復(fù)雜操作。采用自行設(shè)計制作的微流控阻抗檢測芯片，以大腸桿菌為研究對象，對細(xì)菌阻抗檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，考察芯片微管道中大腸桿菌濃度與阻抗之間的定量關(guān)系，構(gòu)建一套操作簡便快速的微流控芯片電化學(xué)阻抗分析系統(tǒng)及檢測方法，并應(yīng)用于污水中細(xì)菌快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑



VersaSTAT3電化學(xué)工作站（美國普林斯頓）、Sension5電導(dǎo)率儀（美國哈希公司）、OLYMPUS IX71顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、SWCJO超凈臺（蘇州凈化公司）。

LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（上海生工）；甘露醇（AR，溫州東升化工）；KH2PO4（AR，重慶川東化工）等。緩沖溶液配制: 0.1 mol/L甘露醇溶液為基質(zhì)，以磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)節(jié)至所需電導(dǎo)率，經(jīng)0.22

m微孔濾膜過濾得緩沖溶液。大腸桿菌標(biāo)本: 大腸桿菌由第三軍醫(yī)大學(xué)檢驗系提供。在LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12～14 h；將菌液以8000 r/min離心2 min，棄去上清液后重懸于緩沖溶液中，離心2～3次，用緩沖溶液懸浮得到菌液。取0.1 mL菌液進(jìn)行梯度稀釋，采用平板計數(shù)法計數(shù)。其余菌液稀釋得系列濃度大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)樣本。

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本: 將大腸桿菌標(biāo)本適當(dāng)稀釋得系列大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本，并采用平板計數(shù)法測定濃度。

細(xì)菌樣本: 以大腸桿菌為主要菌群的某污水池為采樣點，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法采集水樣［13］。取10 mL水樣經(jīng)雙層微孔濾膜過濾（上層濾膜孔徑為4.5

m除雜質(zhì)，下層孔徑濾膜0.22

m截留細(xì)菌）。采用緩沖溶液反復(fù)沖洗0.22

m濾膜的上表面及4.5

m濾膜下表面， 得到1 mL細(xì)菌樣本。

2.2 實驗方法

2.2.1 微流控電化學(xué)阻抗分析芯片和系統(tǒng) 實驗采用自行設(shè)計的含陣列式對電極結(jié)構(gòu)的阻抗檢測芯片（圖1a）［5］。芯片上陣列式電極（圖1b）是通過MEMS技術(shù)在玻璃基片上沉積的金電極，對電極間距k分別為130， 110， 90， 70和50

m，電極寬d1為100

m，相鄰電極間距d2為20

m，應(yīng)用于阻抗檢測的微電極總長L為1780

m，寬度D為1100

m。陣列電極將有效檢測面積增大至0.32 mm2，增加響應(yīng)靈敏度的同時提高信號均勻性和重現(xiàn)性。蓋片采用SU-8陽膜制作的帶有微管道網(wǎng)絡(luò)的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，微管道深度為30

m，寬度為300

m，長度為15000

m，微管道體積1.35×10－4 mL。將玻璃基片和蓋片對位粘合， 即構(gòu)成復(fù)合式玻璃-PDMS微流控阻抗檢測芯片。圖1 微流控芯片電化學(xué)阻抗檢測芯片

Fig．1 Microfluidic chip integrated electrochemical impedance microelectrodes

a. 芯片實物圖（Photograph of microfluidic chip）; b. 微電極結(jié)構(gòu)圖（Scheme of microelectrodes on microchip）。

微流控芯片電化學(xué)阻抗分析系統(tǒng)包含復(fù)合式玻璃-PDMS微流控阻抗檢測芯片、電化學(xué)測試儀和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。在芯片管道兩端連接軟支管道，使緩沖溶液（0.5

L）充滿管道，液差驅(qū)動大腸桿菌懸浮液進(jìn)入微管道，大腸桿菌懸浮液進(jìn)樣量約5

L，流速約1

L/min；電化學(xué)測試儀由引線1和2連接微流控芯片，對樣本進(jìn)行電化學(xué)阻抗檢測；數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集并保存數(shù)據(jù)。

分 析 化 學(xué)第39卷

第9期彭金蘭等: 微流控芯片上大腸桿菌的電化學(xué)阻抗檢測方法研究

2.2.2 芯片上大腸桿菌電化學(xué)阻抗檢測條件優(yōu)化 在緩沖溶液電導(dǎo)率為2.47

S/cm，掃描頻率1.0～1.0×106 Hz，新制大腸桿菌標(biāo)本靜置90 min的條件下，測定不同擾動振幅（50～900 mV）下大腸桿菌標(biāo)本（1.49×107 CFU/mL）的阻抗譜，確定擾動振幅。

緩沖溶液電導(dǎo)率分別為2.20， 4.17， 6.11， 9.38和13.13

S/cm，分別配制濃度為1.49×107 CFU/mL的大腸桿菌懸浮液并靜置90 min。在優(yōu)化擾動振幅下，掃描頻率1.0～1.0×106 Hz，對不同電導(dǎo)率緩沖溶液和大腸桿菌懸浮液進(jìn)行阻抗檢測。

在已優(yōu)化條件下，測定10 kHz下新制細(xì)菌標(biāo)本阻抗與靜置時間的關(guān)系曲線，確定最佳靜置時間。

2.2.3 芯片上大腸桿菌樣品定量檢測

在優(yōu)化條件下，對系列濃度（7.43×105～1.49×108 CFU/mL）大腸桿菌標(biāo)本進(jìn)行電化學(xué)阻抗檢測，建立定量關(guān)系曲線。在優(yōu)化條件下，對經(jīng)平板計數(shù)法測得濃度為1.39×107 CFU/mL細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本進(jìn)行多次測試，考察重現(xiàn)性；對系列濃度（7.43×104～1.49×107CFU/mL）大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本進(jìn)行阻抗檢測和顯微觀察，確定檢出限。按照國標(biāo)法［14］對水樣進(jìn)行計數(shù)，即: 將水樣作10倍稀釋，逐步倍比稀釋得到101，102，103，104，105，106倍稀釋水樣，并進(jìn)行平板計數(shù)。在優(yōu)化條件，對2.1所述的細(xì)菌樣本進(jìn)行阻抗檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 芯片上大腸桿菌電化學(xué)阻抗檢測條件優(yōu)化

3.1.1 擾動振幅優(yōu)化 將大腸桿菌標(biāo)本靜置90 min，測定不同擾動振幅（50～900 mV）下大腸桿菌標(biāo)本的阻抗譜（圖2）。隨著擾動振幅的逐漸降低，阻抗波動越明顯，尤其是低頻段。研究顯示［15］，只要不出現(xiàn)高次諧波，高阻抗系統(tǒng)的擾動幅值可以稍大。因此選擇500 mV作為擾動振幅。

圖2 不同擾動振幅下細(xì)菌標(biāo)本阻抗檢測lg｜Z｜-lgf關(guān)系圖

Fig．2 lg｜Z｜-lgf curve of standard samples of E.coli suspension at different amplitude of potential. Frequency range， 1.0～1.0×106 Hz; Conductivity of buffer， 2.47

S/cm

3.1.2 緩沖溶液電導(dǎo)率優(yōu)化 將大腸桿菌標(biāo)本靜置90 min，考察緩沖溶液電導(dǎo)率對阻抗的影響（圖3）。隨著緩沖溶液電導(dǎo)率的升高，等濃度大腸桿菌懸浮液引起的阻 圖3 不同電導(dǎo)率緩沖介質(zhì)中大腸桿菌懸浮液Δ｜Z｜-lgf關(guān)系圖

Fig．3 Δ｜Z｜-lgf curve of E. coli suspension in different buffer solution． Frequency range， 1.0～1.0×106 Hz; Amplitude of applied sine-wave potential， 500 mV抗變化減小。當(dāng)緩沖溶液電導(dǎo)率高于10

S/cm 時，等濃度大腸桿菌懸浮液引起的阻抗變化很小。緩沖溶液電導(dǎo)率較低時，等濃度大腸桿菌懸浮液引起的阻抗變化明顯。因此，最佳電導(dǎo)率為2.20～4.64

S/cm。



由圖2和圖3可知，頻率低于100 Hz時，外界低頻電磁場干擾造成阻抗譜波動明顯。因此，選1.0×102 ～ 1.0×106 Hz為最佳掃描頻率范圍。

3.1.3 新制大腸桿菌懸浮液靜置時間優(yōu)化

新制大腸桿菌標(biāo)本阻抗隨時間的變化關(guān)系曲線如圖4所示。在40 min內(nèi)，新制大腸桿菌標(biāo)本阻抗變化明顯，隨后阻抗僅有微小變化。1 h時，大腸桿菌標(biāo)本基本達(dá)到平衡狀態(tài)，故選1 h為最佳靜置時間。

3.2 芯片上大腸桿菌電化學(xué)阻抗檢測定量分析

在最佳測試條件下，對系列濃度大腸桿菌標(biāo)本（7.43×105～1.49×108 CFU/mL）進(jìn)行電化學(xué)阻抗檢測。如圖5所示， 大腸桿菌標(biāo)本阻抗隨著細(xì)菌濃度升高而逐漸降低。以大腸桿菌濃度（C）為橫坐標(biāo)，以某頻率下阻抗（｜Z｜）為縱坐標(biāo)，建立細(xì)菌標(biāo)本｜Z｜與C的關(guān)系曲線。在高頻段（1.0×105～1.0×106 Hz），大腸桿菌標(biāo)本｜Z｜與C呈對數(shù)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)較低；在1.0×104～1.0×105 Hz范圍內(nèi)，細(xì)菌標(biāo)本｜Z｜與C的關(guān)系復(fù)雜、相關(guān)系數(shù)也較低；在低頻段（1.0×102～1.0×104 Hz），大腸桿菌標(biāo)本｜Z｜與C呈對數(shù)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.95。采用1.0×102～1.0×104Hz頻率段的阻抗數(shù)據(jù)建立定量曲線（圖4），曲線方程為 ｜Z｜＝－2.58×105lnC＋4.905×106。測試范圍在7.43×105～1.49×108 CFU/mL。

圖4 大腸桿菌溶液阻抗｜Z｜與靜置時間t關(guān)系曲線

Fig．4 ｜Z｜-t curve of E. coli suspension

Frequency range， 1.0－1.0×106 Hz; Amplitude of applied sine-wave potential， 500 mV; Conductivity of buffer， 2.59

S/cm

圖5 細(xì)菌標(biāo)本懸浮液阻抗檢測｜Z｜-C定量曲線

Fig．5 Relationship between concentration of E. coli suspension and impedance

3.3 合成樣本分析

在優(yōu)化條件下，對經(jīng)平板計數(shù)測得濃度為1.39×107 CFU/mL大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本進(jìn)行測試（表1），RSD為4.75%（n＝5），平均值的相對誤差為1.44%，表明本方法的測試精密度好。 

在優(yōu)化條件下，對系列濃度大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)合成樣本（7.43×104～1.49×107 CFU/mL）進(jìn)行阻抗檢測，并對微管道中大腸桿菌進(jìn)行實時顯微觀測。結(jié)果顯示，當(dāng)大腸桿菌濃度為1.49×105 CFU/mL時，芯片微管道內(nèi)約22個大腸桿菌，系統(tǒng)有阻抗變化明顯；而大腸桿菌濃度為7.43×104 CFU/mL，芯片微管道檢測區(qū)域內(nèi)約11個細(xì)菌，系統(tǒng)阻抗有變化；大腸桿菌濃度降低至4.65×104 CFU/mL，系統(tǒng)阻抗變化已不明顯，可認(rèn)為系統(tǒng)的檢出限可達(dá)到7.43×104 CFU/mL。

3.4 污水中大腸桿菌檢測

以某污水為分析樣本，按照2.1及2.2.4所述方法進(jìn)行采樣、計數(shù)、預(yù)處理及檢測。結(jié)果顯示，濾液經(jīng)培養(yǎng)計數(shù)，無菌落，說明大腸桿菌完全被截留；濾膜貼在瓊脂板上培養(yǎng)48 h，約有20～40個菌落，沖洗率約為99.6%；國標(biāo)法與本方法檢測結(jié)果如表2所示。采用F檢驗法判斷國標(biāo)法與本方法檢測結(jié)果的差異性，F(xiàn)＝9.22＜F0.95（8，2）＝19.37，說明兩種方法檢測結(jié)果無顯著性差異。

相比于現(xiàn)行國標(biāo)方法，本方法只需經(jīng)簡單膜過濾即可進(jìn)行檢測，2 min可以完成單樣本檢測，20 min內(nèi)即可完成污水中細(xì)菌檢測分析，省去了48 h培養(yǎng)過程，縮短了分析時間。本方法不需要專門培養(yǎng)、吸附處理及電穿透處理，具有檢測時間短，操作簡單，精密度高等特點，在細(xì)菌快速檢測方面具有應(yīng)用價值。

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Determination of E. coli with Electrochemical Impedance on

Homemade Microfluidic Chip

PENG Jin-Lan1，2， XU Yi*1，2，3， WU Yong-Jie1，3， CHUAN Na1， GAN Jun1， TIAN Peng2，3

（Chemistry and Chemical Engineering College1， Defense Key Disciplines Lab of Novel Micro-nano

Devices and System Technology2， International R D center of Micro-nano Systems and

New Materials Technology3， Chongqing University， Chongqing 400030）

Abstract Based on the impedance properties of bacterial suspension and microfluidic impedance analytical technology on microchip， the homemade microfluidic impedance analytical system and a rapid and simple quantitative analytical method of bacterial were proposed. In the experiment， E. coli was taken as the detecting sample. Some parameters， such as amplitude of perturbation， conductivity of buffer， scanning frequency range and time of deposition， were optimized. The impedance signals of the standards and the composite samples of E. coli were measured by the homemade microsystem. Under the conditions of perturbation at 500mV， conductivity of buffer at 2.40

S/cm， scanning frequency ranged from 1 MHz to 100 Hz and so on， it was found that the quantitative relationship between the impedance and the concentration of the E. coli was in the range of 7.43×105 to 1.49×108 cfu/mL， and the detection limit was 7.43×104 cfu/mL. In this study， more than 10 cfu E. coli in the testing region of the microchannel on the microchip could be detected. When the concentration of the E. coli was at 1.39×107 cfu/mL， the RSD of the detection was 4.75%（n＝5）. This methodology was applied to detect E. coli in sewage， the results were basically the same as that of national standard method.

Keywords E.coli; Microfluidic chip; Homemade microfluidic impedance analytical system; Quantitative detection

（Received 23 December 2010; accepted 30 May 2011）