流動注射分光光度法快速測定乳制品中的蛋白質含量

摘 要 建立了快速測定乳制品中真蛋白質含量的交替合并帶異步注入流動注射分光光度法。樣品和試劑自動同時定量，分別同時被注入到超純水和緩沖液中，以合并帶中試樣包裹試劑的方式進行匯合、反應，生成的藍色絡合物進入流通檢測器，在595 nm下進行定量分析。得到的最佳測定條件為：反應試劑中考馬斯亮藍的濃度為150 mg/L，緩沖液中HCl的濃度為1.0% （V/V），NaCl的濃度為0.1 mol/L，采樣體積為150 L，顯色劑注入體積為30 L，反應盤管長度為200 cm，系統總流量為2.65 mL/min， 分析速度為60 樣/h， 方法的線性范圍為0.5～15.0 mg/L； 相對標準偏差小于1.9%（n＝11）， 檢出限為0.05 mg/L， 回收率為 93.9%～107.3%； 。本系統的人為誤差小， 自動化程度高， 重現性好， 分析速度快， 試劑用量少，且不受三聚氰胺、尿素等假蛋白的干擾，實現了對乳制品中真蛋白質含量的簡便、快速、準確測定。

關鍵詞 流動注射分析；合并帶異步注入；分光光度法；考馬斯亮藍；蛋白質測定；乳制品

1 引 言

蛋白質是人體必需的重要營養素之一， 乳制品是人體重要的蛋白質來源。 因此，蛋白質含量是評價乳制品質量的重要指標?，F行乳品中蛋白質含量的測定方法為凱氏定氮法，其測定結果會受到三聚氰胺、尿素等假蛋白的影響。2007年4月美國的“寵物食品污染事件”和2008年9月中國的“三聚氰胺污染牛奶事件”，都是因為食品中添加了三聚氰胺造成的。因此，開發更為準確的測定乳制品中真實蛋白質含量的方法成為研究重點。

目前，測定蛋白質的常用方法有分光光度法，包括紫外分光光度法、染料比色法、金屬絡合比色法等。其中，考馬斯亮藍G 250 （Coomassie brilliant blue G 250，CBBG）比色法\\ 常用于生命科學和臨床醫學領域中蛋白質的檢測，具有反應速度快、靈敏度高等優點。當用于測定乳制品中的蛋白質含量時，樣品中的其它物質（多肽、乳糖等）均不與CBBG發生反應，干擾因素少， 測定準確。目前，CBBG比色法在用于乳品檢測時也存在一些不足之處，如預處理過程繁瑣， 樣品濁度對測定結果影響較大， 分析速度慢等；另外，由于CBBG與蛋白質的反應產物不溶于水，極易沾染器壁，需用乙醇進行清洗，影響分析速度，且增大了試劑耗量，從而限制了其在乳品蛋白檢測領域的推廣應用。

流動注射分析技術 \\具有分析速度快、試劑消耗量少、檢出限低、重現性好等優點，并且常與不同的檢測器聯用。流動注射交替合并帶技術（Alternating merging zone flow injection analysis， AMZ- FIA）是將試劑和樣品分別以“試劑塞”和“試樣塞”的形式同時注入流路中，兩者在反應盤管中匯合后進行反應，此方法可同時減小試劑和樣品用量，且實現了采樣、采試劑和測樣同時進行。本研究基于CBBG比色法和AMZ-FIA法，建立了一種能用于快速定量乳制品中蛋白質含量的新方法（Protein/ CBBG-AMZ-FIA）和新系統。采用本方法測定樣品只需經稀釋后即可直接進行測定，避免了預處理過程造成的誤差，提高了測定的準確度和分析速度。本方法已成功用于乳制品中蛋白質含量的準確測定。

2 實驗部分

2.1 儀器及試劑

FIA-3100型流動注射儀（吉天儀器有限公司）； UVIDEC-100-VI型流通式紫外可見分光光度計（日本分光株式會社）； AUW型電子天平（日本島津公司）； HM-7B型pH計（日本東亞電波公司）。除反應盤管內徑為0.5 mm外，其它FIA管線均用0.8 mm的PTFE管。

考馬斯亮藍G 250（CBBG，寶信生物技術公司）； 牛血清白蛋白（BSA，麗珠生物技術公司）； 無水乙醇、HCl、NaCl、乳糖、β-環糊精（科龍化學試劑公司）； 三聚氰胺標準品和尿素標準品（上海安譜科學儀器有限公司）。所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水（電導率為0.065 S/cm）。

反應液：150.0 mg CBBG固體溶于50 mL乙醇 （95%， V/V） 并用水定容至1000 mL。BSA標準儲備液（100.0 mg/L）由10.0 mg的BSA溶于水，并定容至100 mL。

2.2 樣品的預處理 圖1 用于測定乳制品中真蛋白質含量的流動注射分析流路

Fig．1 Flow injection analysis manifold for determination of real protein in dairy products

LS1. 第一試樣定量環（The first sample loop）; LS2. 第二試樣定量環（The second sample loop）; LR1. 第一試劑定量環（The first reagent loop）; LR2. 第二試劑定量環（The second reagent loop）; DA. 數據采集器（Data acquisition）。

液態乳品的配制：準確量取1.0 mL樣品于100 mL容量瓶中，并用水定容，作為母液；當樣品的蛋白質含量＞20 mg/g（≤20 mg/g）時，量取母液1.0 mL（2.0 mL）于100 mL容量瓶中，用水定容，待測。

固體乳粉的配制：準確稱取0.10 g樣品，用水溶解并定容至100 mL，作為母液；量取樣品母液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，待測。

2.3 FIA系統及測定過程

流動注射分析系統如圖1所示。測定過程是：當多功能閥處于檢測位1時，試樣定量環1（LS1）和試劑定量環1（LR1）中的樣品和反應液分別在超純水和緩沖液的推動下，進入反應盤管中，以合并帶中試樣包裹試劑方式進行匯合、反應，生成藍色絡合物，并在595 nm處檢測，以數據采集器（DA）采集記錄響應信號。同時，在泵B的作用下，樣品和反應液分別進入試樣定量環2（LS2）和試劑定量環2（LR2），當樣品和反應液分別充滿定量環后，閥自動轉至檢測位2，LS2和LR2中的“試樣塞2”和“試劑塞2”被注入到系統中，進行下一次測定。

3 結果與討論



實驗均在室溫下進行。為盡可能降低空白值，在多功能閥定量環兩個連接口的有限距離內，選用30

L試劑定量環。在此基礎上，對采樣體積、CBBG濃度、反應盤管長度、系統總流量、緩沖液中HCl和NaCl的濃度等的影響進行了考察。

3.1 體系的吸收光譜

在強酸性 （pH<1.25） 條件下，當CBBG分子與蛋白質分子混合時，兩者通過SO－3與NH＋3的靜電作用，生成一種藍色物質見式（1）。

（1）

因此，在體系pH 1.1的條件下，由CBBG（a）和CBBG與BSA混合物（b）的吸收光譜（圖2）可見，CBBG分別在465和650 nm處存在兩個吸收峰，而CBBG與BSA的混合物的最大吸收波長為595 nm。本實驗的檢測波長為595 nm。

圖2 CBBG溶液（a）及CBBG-BSA混合液（b）的吸收光譜

Fig．2 Absorption spectra of coomassie brilliant blue G 250 （CBBG） （a） and CBBG-BSA mixture solution （b）

3.2 分析條件的優化

3.2.1 進樣體積對吸光度的影響 選用10和30 mg/L的BSA標準溶液，在30～340

L范圍內考察了進樣體積對產物吸光度值的影響。實驗條件：試劑注入體積30

L，CBBG濃度為100 mg/L，試樣定量環和試劑定量環出口與反應盤管之間連接管的長度分別為15和20 cm，反應盤管（RC）長度為150 cm，系統出口總流量為4.39 mL/min。實驗表明，進樣體積在30～150

L范圍內，隨著進樣體積的增大，吸光度值逐漸增加（10 mg/L：0.051→0.171，30 mg/L：0.145→0.315）；當進樣體積大于150

L時，吸光度值趨于平穩。本實驗進樣樣品體積選定為 150L。

3.2.2 CBBG濃度對吸光度的影響 考察CBBG濃度在30～200 mg/L范圍內對測定空白值和產物吸光度的影響，結果見圖3。隨著CBBG濃度的增加，空白值緩慢增大，而產物吸光度值呈現先迅速增大然后逐漸變緩的趨勢。當CBBG濃度大于125 mg/L時， 圖3 CBBG濃度對空白值及反應產物吸光度的影響

Fig．3 Effect of concentration of CBBG on blank value and absorbance of reaction product空白值與產物吸光度的增大趨勢幾乎相同。即此時CBBG濃度的變化不會對反應體系的靈敏度產生影響；繼續增大CBBG的濃度，只會導致空白值的增加。為了減小對空白吸光度的影響，同時又要保證有足量的CBBG參與反應，本研究選定CBBG濃度為150 mg/L。

3.2.3 反應盤管長度及總流量對吸光度的影響 在FIA系統中，反應盤管長度及系統的總流量會影響反應進程和分析速度。在30～500 cm范圍內，考察了反應盤管長度對吸光度的影響（圖4a）。隨著反應盤管長度的增加，吸光度值先增加后降低；當反應盤管長度為200 cm時，吸光度值最大。本研究選定反應盤管的長度為200 cm。在此基礎上，在0.88～4.39 mL/min范圍內考察總流量對吸光度的影響（圖4b）。隨著系統總流量的逐漸增加，吸光度值先增大再減?。划斂偭髁繛?.65 mL/min時，吸光度達到最大值。因此，選定系統的總流量為2.65 mL/min。

3.2.4 緩沖液中HCl及NaCl濃度的影響 在FIA系統中，體系的酸度會影響CBBG分子的存在形式、測定的空白值及CBBG與蛋白質的反應程度。因此，需要對體系酸度的影響進行考察。根據文獻\\，用HCl-NaCl緩沖液作為酸度調節劑時，方法的線性關系良好。本研究選擇HCl-NaCl緩沖液作為體系酸度的調節劑。并選用10和30 mg/L BSA標準溶液分別考察HCl（0.2%～3.0%， V/V）和NaCl（0～0.5 mol/L）的濃度對結果的影響。實驗表明，隨著HCl濃度的增大，吸光度 （A）先增大后減小\\A: 0.133→0.169→0.127（10 mg/L）， 0.308→0.352→0.274（30 mg/L）\\〗；當HCl濃度為1.0%時，吸光度值最大\\A: 0.169 （10 mg/L）， 0.352 （30 mg/L） \\〗；隨著NaCl濃度的增加，吸光度逐漸增大\\；當NaCl濃度大于0.1 mol/L時，吸光度值趨于平穩。因此，選定緩沖液中HCl濃度為1.0%，NaCl濃度為0.1 mol/L。

3.2.5 液態乳品稀釋倍數的考察 由于乳制品中存在大量不溶于水的乳脂，使得牛奶呈現出藍白色。當牛奶樣品用FIA系統進行直接測定時，其濁度所產生的吸光度會影響蛋白質的測定結果。減小濁度影響的最簡便方法是稀釋。在最佳的實驗條件下，

分別選用純牛奶（蛋白質含量≥29 mg/g）和花生核桃奶（蛋白質含量≥10 mg/g），考察了乳制品吸光度（濁度）隨稀釋倍數（100～10000）的變化曲線。從圖5可見，隨著稀釋倍數的增大，樣品的吸光度（濁度）逐漸減?。划敇悠分械鞍踪|含量≤20 mg/g時，稀釋5000倍后即可忽略濁度影響；當樣品中蛋白質含量＞20 mg/g時，需要稀釋10000倍才可消除濁度的影響。

3.3 干擾實驗

乳制品的稀釋液中主要含有蛋白質、脂類、乳糖以及一些食品添加劑（如環糊精）等。其中，由于脂類所引起的濁度的影響已經通過稀釋消除。乳糖和環糊精對測定結果的影響實驗表明，在0.5～50.0 mg/L濃度范圍內，兩種物質均不影響產物的吸光度，回收率范圍為98.4%～102.2%。為了增加樣品的表觀蛋白質含量，一些不法商人將一些氮含量高的有機化合物加入到乳制品中，以提高其蛋白質含量，如三聚氰胺和尿素等。在BSA標準溶液中分別添加一定濃度的三聚氰胺和尿素，利用本FIA系統考察兩者對BSA標準溶液測定的影響，三聚氰胺和尿素的添加范圍均為0.5～50.0 mg/L。結果表明，在考察的濃度范圍內，兩者對測定結果均未見影響，回收率為98.4%～101.6%。

為進一步考察三聚氰胺對乳制品中蛋白質測定的影響，將三聚氰胺分別加入到不同乳制品的稀釋液中，進行了測定，結果見表1。即使當三聚氰胺的濃度為樣品稀釋液中蛋白質濃度的10倍時，也不會影響測定的吸光度，回收率范圍為96.6%～102.4%。

3.4 乳制品樣品的測定

在最佳實驗條件下，分別用0.5和5.0 mg/L BSA標準液作為樣品，進行重現性實驗（n＝11），得到的相對標準偏差（RSD）小于1.9%，表明系統重現性良好。經計算，本方法的檢出限（CL）為0.05 mg/L （CL＝3S/k）。BSA濃度在0.5～15.0 mg/L范圍內，與吸光度呈良好的線性關系（ΔA＝0.0176C＋0.0089，r＝0.9999）。對不同種類的乳制品進行了分析和回收實驗，結果見表2，回收率在 93.9%～107.3% 之間。

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Rapid Determination of Real Protein Content in Dairy

Products by Flow Injection-Spectrophotometry

LIANG Qin-Qin， LI Yong-Sheng*

（School of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065）



Abstract Based on asynchronous-injection alternating merging zone technology， a flow-injection spetrophotometry for fast determination of real protein content in dairy products was established. Sample and coomassie brilliant blue G250（CBBG） solution were loaded into loops simultaneously and automatically， injected into two carriers， respectively， then merged and reacted in manner of sample enwrapping reagent， and the formed blue complex was determined at 595 nm. Optimized conditions were as follows: concentrations of CBBG， NaCl and HCl were 150 mg/L， 0.1 mol/L and 1.0%（V/V）， respectively; volumes of the sample and reagent were 150

L and 30

L， respectively; length of a reaction coil was 200 cm; total flow rate was 2.65 mL/min. The linear range of the method was 0.5－15.0 mg/L， relative standard deviation was less than 1.87% （n＝11）， its detection limit was 0.05 mg/L， and analytical speed was 60 samples per hour. Merits of the system were less error， high automation， good reproducibility， fast analysis speed， and less cost. Moreover， the determination results of this method were not interfered by some pseudo protein such as melamine and urea. The method has been applied to the determination of real protein in dairy products.

Keywords Flow injection analysis; Asynchronous-injection merging zone; Speotrophotometry; Coomassie brilliant blue; Protein determination; Dairy products

（Received 27 March 2011; accepted 6 April 2011）