超聲波破碎-高效液相色譜法定量檢測核酸

摘 要 采用超聲波破碎結合高效液相色譜技術，建立了定量檢測質粒DNA的方法，測量結果可以溯源至核苷酸標準物質。采用超聲波破碎（功率300 W，頻率24 kHz）技術將質粒DNA破碎成200～500 bp的小片段DNA，再用蛇毒磷酸二酯酶將其水解為4種核苷酸（dCMP：3.2 min；dTMP：4.7 min；dGMP：5.3 min，dAMP：6.8 min），將產物通過HPLC分離后，采用外標法進行定量分析。應用此方法對待測質粒 pNK603進行定量分析，測定的4種核苷酸的摩爾百分比（A∶T＝0.95， C∶G＝0.98）與理論值接近。本方法的測定結果（47.24 g/g）與實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR，45.98 g/g）和PicoGreen 熒光染料法（46.02 g/g）的測定結果沒有顯著差異，表明建立的超聲波-HPLC方法可以應用于質粒DNA的定量分析。

關鍵詞 質粒； 超聲波破碎； 高效液相色譜； 熒光； 聚合酶鏈式反應

1 引 言

核酸是生物遺傳信息的載體，對核酸的定量分析是解析核酸結構和功能的基礎。目前定量分析核酸的方法根據其原理的不同分為兩類：一類是直接定量檢測核酸，主要是通過應用標記探針的雜交反應進行定量檢測；另一類是將待測核酸擴增后，再通過酶免疫法（EIA）、發光分析、熒光分析等方法定量檢測擴增產物，主要是定量聚合酶鏈式反應（PCR）技術。

在應用上述方法測定核酸含量時，其測量結果的溯源性、可比性還未引起關注。但是，在核酸標準物質制備過程中（如質粒分子標準物質），其核酸測量溯源的重要性就凸顯出來。為了解決核酸定量測量的準確、溯源問題，各國都在進行探索。本研究試圖通過色譜或質譜技術建立一個可溯源的高準確度的測量方法，即將雙鏈的基因組或質粒核酸水解成單核苷酸，通過同位素稀釋質譜法測定水解后的核苷酸的含量，據此計算核酸的濃度； 還可根據核酸序列信息及4種核苷酸的摩爾濃度檢查核酸水解是否完全。應用這種方法測定的結果可以溯源到核苷酸標準品，從而解決核酸測量的溯源問題。

目前，應用同位素稀釋質譜測定寡核苷酸（20 mer）濃度的方法已經比較成熟，但是對于雙鏈，且長度大于幾百個堿基對的核酸片段的定量分析，除了紫外吸收法、定量PCR和熒光染料法外，由于缺乏相應的標準品，還沒有其它成功的方法可用。長片段核酸無法直接完全酶解，因此，建立一個可以將長片段核酸碎裂為小片段核酸進而可以完全水解的方法，是實現大片段核酸的色譜、質譜及毛細管電泳定量分析的關鍵。本實驗的目的是以質粒DNA為分析對象，利用超聲波破碎技術將其破碎成小片段DNA，通過優化條件使其破碎后的產物可以進行完全酶解，酶解產物利用高效液相色譜（HPLC） 進行定量分析，以期建立一個溯源鏈清晰，準確度高的核酸定量測量方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200液相色譜儀（安捷倫中國有限公司）； 酶標儀（M200，TECAN）、熒光定量PCR儀（AB7900HT，美國ABI公司）； JY92ⅡD超聲波破碎儀（南京新辰公司）。Taqman Universal MasterMix 試劑盒（4304437，美國ABI公司）；SB-AQ色譜柱（150 mm×4.6 mm，安捷倫中國有限公司）；特異性引物和探針（上海英俊公司合成），其中探針5′端采用熒光標記基團FAM進行標記，3′端采用熒光猝滅基團TAMRA進行標記。具體序列見表1。乙腈（色譜純）、蛇毒磷酸二酯酶（SVP）、4種核苷酸標準品，均購自美國Sigma公司。

L SVP緩沖液，37 ℃酶解3 h，85 ℃酶解20 min。設置3個平行，分別以不加SVP和不加DNA樣品為酶解樣品的對照。同時將未經超聲波處理的質粒 DNA直接進行酶解作為超聲波處理樣品的對照。

2.2.2 HPLC分析 將酶解后的樣品經12000 g離心2 min，取上清液轉入液相小瓶，上樣進行HPLC分析。流動相A：20 mmol/L醋酸銨（pH 3.5）；流動相B：乙腈。梯度洗脫：0～5 min， 100% A；5～10 min， 90% A；10～20 min：90% A；20～25 min：100% A。流速：1 mL/mim，進樣量20 L。檢測波長254 nm。

2.2.3 熒光定量PCR擴增及定量標準曲線的制作 為了與HPLC方法測定質粒濃度結果進行比較，將相同的質粒DNA樣品進行熒光定量PCR擴增，測定其濃度。采用表1中的引物和優化的擴增體系 進行PCR擴增。擴增條件： 95 ℃， 5 min；45個循環： 95 ℃，15 s； 60 ℃，1 min。

標準曲線的制作：將質粒DNA用熒光染料法測定濃度后，梯度稀釋成5個標準溶液，采用上述條件和體系進行擴增，以初始質粒標準溶液濃度的對數為橫坐標，以擴增得到的Ct值為縱坐標作圖。

拷貝數（L）與質量濃度（C）換算公式：L＝CDNA ×6.02×1023/（3301×660）

其中，CDNA為質粒濃度（g/L）；3301為質粒分子的堿基對個數；660為每個堿基對的平均分子量。

2.2.4 熒光染料法測定質粒DNA濃度 采用PicoGreen試劑盒法對待測質粒DNA樣品進行濃度測定，具體方法見PicoGreen操作說明書。

3 結果與討論

3.1 質粒DNA的超聲波破碎

將質粒DNA進行超聲波破碎處理后，采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。第7泳道為未經處理的質粒，1～6泳道依次為超聲處理 10 min， 15 min， 20 min， marker，30 min和50 min。由此可見，超聲波處理50 min后，質粒pNK603由原來的3.4 kbp破碎成了主帶在200～500 bp的DNA片段。增加超聲波處理功率，破碎結果沒有明顯差異。另外，通過膠回收測定超聲波破碎效率，發現超聲波破碎質粒DNA的最佳濃度為30～90 g/g； 濃度大于200 g/g，破碎的效率降至50%。

3.2 酶解及HPLC分離

將超聲破碎后的DNA片段進行酶解，酶解后的產物經HPLC分離，分離結果見圖2。圖2a為4種核苷酸標準品的分離結果，根據出峰先后順序，4個峰分別為dCMP （3.2 min），dTMP（4.7 min），dGMP（5.3 min）和dAMP（6.8 min）。圖2b為質粒DNA破碎、酶解后產物的分離結果。質粒DNA經過超聲波破碎和酶解后的產物為4種核苷酸， 圖2 核苷酸標準品及質粒 pNK603水解產物的HPLC分離結果

Fig．2 Separation of standard nucleotides and hydrolyzed products of pNK603 by HPLC

（a）. 4種核苷酸標準品分離結果；（b）.超聲波破碎處理質粒pNK603水解產物分離結果；（c）. 未經超聲波處理質粒水解產物分離結果。 （a）. separation of standard nucleotides; （b）. hydrolyzed products of ultrasonic treated plasmid pNK603; （c）. hydrolyzed products of plasmid pNK603 without ultrasonic treat; the abscissa is retention time: min）且4種核苷酸在該實驗條件下得到了理想的分離效果。圖2c為沒有經過超聲波處理的質粒直接酶解后的產物分離結果，該結果與超聲波處理后進行酶解的質粒DNA水解結果不同，未有發現 dTMP對應的吸收峰，而在保留時間為12.9， 18.7和22.2 min 處出現了新的吸收峰，這表明未經過超聲波處理的質粒DNA直接進行酶解，沒有完全水解。因此，超聲波處理對質粒DNA的完全水解起關鍵作用，而質粒是否完全水解直接影響質粒DNA濃度的測定結果。

3.3 HPLC定量分析核苷酸

采用面積歸一化法對超聲處理的質粒DNA進行定量分析，4種核苷酸的標準曲線方程和線性相關系數見表2。4種核苷酸的標準曲線線性相關系數均大于0.99，可見4種核苷酸的濃度與其峰面積的線性相關性很好。根據標準曲線產生的標準方程對質粒DNA水解后的4種核苷酸進行定量分析。4種核苷酸的質量濃度之和，即待測質粒的濃度（47.24 g/g）。測定的摩爾百分含量值與理論摩爾百分含量值非常接近。另外， 根據測定結果計算出的A:T（0.95）和C:G（0.98）的值與理論值1也很接近。

1 dcMP: Deoxycytidylic acid; dTMP: Thymidylic acid; dGMP： Doxyguanylic acid; dAMP: Deoxyadenylic acid.長片段、雙鏈DNA只有完全水解成核苷酸后，利用HPLC進行定量分析的結果才能準確。未經超聲波處理，直接進行磷酸二酯酶水解的質粒DNA， 從HPLC分離結果表明，DNA沒有完全水解；而經過超聲波處理后的質粒DNA，用磷酸二酯酶水解，水解后測定的A∶T和C∶G的值與理論值非常接近，表明超聲波破碎后的DNA片段水解基本完全。

3.4 熒光定量PCR定量分析

采用熒光定量PCR對未經處理的質粒上的兩個基因片段（ zSSIIb和NK603）進行定量分析。測定結果為1.27×1010拷貝/ L，換成質量濃度為45.98 g/g。

3.5 3種方法比較

將3種方法測定質粒DNA濃度的結果進行比較，結果見表3。熒光定量PCR方法與PicoGreen方法的測定結果非常一致，而HPLC方法測定結果與之比較偏高。文獻\\報道，PicoGreen熒光染料法用于測定小于23 kbp的DNA片段的濃度時，其結果通常都偏低，原因是該方法基于熒光染料法定量，且依賴于試劑盒內的標準DNA，而這個標準DNA為

SymbollA@ -DNA，長度大于23 kbp，因此對于長度小于23 kbp的DNA，其與熒光染料的結合率低于

SymbollA@ -DNA。實時熒光定量PCR方法在建立定量標準曲線時， 對初始質粒pNK603濃度的測定也依賴于該試劑盒，所以熒光定量PCR方法與PicoGreen熒光染料法的測定結果均偏低。HPLC方法定量結果與實時熒光定量PCR和PicoGreen熒光染料法的測定結果無顯著差異，從而證明超聲波破碎作為將質粒等大片段DNA破碎成小片段DNA，進而采用HPLC方法定量的可行性。

此外，超聲波-HPLC方法的相對標準偏差（RSD）為2.5%，優于其它兩種方法。但是檢出限和定量限遠不如其它兩種方法。超聲波-HPLC法、PicoGreen染料法和熒光定量PCR法測定結果的合成相對不確定度分別為3.30%， 4.56%和2.46%（表3）。

建立的超聲波破碎-HPLC方法實現了對核酸大分子物質的定量分析，測定結果溯源至核苷酸標準品，從而解決了核酸定量測定的溯源性問題。本方法與熒光定量PCR或熒光染料法相比，準確度相當，精密度略優，而且不需要價格昂貴的熒光探針或熒光染料等試劑。但是由于超聲波-HPLC方法利用HPLC定量，受HPLC定量的靈敏度限制，本方法在測定低濃度DNA時存在局限。

References

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Abstract A new traceable DNA quantification method by HPLC with ultrasonic splitting was set up in this study and the measurement can be traceable to nucleotides. First， the large fragment of DNA such as plasmid DNA， was cut into 200－500 bp by ultrasonic （power at 300 W， frequency at 24 kHz） and then the products were hydrolyzed to four kinds of nucleotide （dCMP: 3.2 min; dTMP: 4.7 min; dGMP: 5.3 min; dAMP: 6.8 min） by snake venom phosphodiesterase. Finally， the hydrolyzed products were separated and quantified by HPLC. The mole percentage of each nucleotide in plasmid pNK603 measured by HPLC （A∶T＝0.95， C∶G＝0.98） was close to its corresponding theoretical value. Additionally， there was no significant difference among the results determined by ltrasonic-HPLC （47.24 g/g）， real time PCR （45.98 g/g） and PicoGreen kit （46.02 g/g）. This indicates the technique of ultrasonic-HPLC can be successfully applied to plasmid DNA quantification.Keywords Plasmid; Ultrasonic splitting; High performance liquid chromatography; Real time polymeras chain reaction

（Received 4 January 2011; accepted 15 April 2011）