脫氧核糖核酸甲基化分析方法在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用

摘 要 脫氧核糖核酸（DNA）甲基化是表觀遺傳改變的主要作用方式，在基因表達(dá)調(diào)控、基因組印跡、胚胎發(fā)育、維持正常細(xì)胞功能等過程中起著極其重要的作用；異常甲基化可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，探討甲基化形成與改變的可能機(jī)制，建立準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡單的DNA甲基化分析方法，可為某些腫瘤的早期診斷提供重要依據(jù)。本文綜述了DNA甲基化的幾種重要分析方法，著重介紹了直接測序法、甲基化特異性PCR方法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、熒光法、電化學(xué)方法以及光度分析法等的原理及優(yōu)缺點(diǎn)；并介紹了DNA甲基化在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用；最后展望了DNA甲基化分析檢測方法的研究前景及應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 脫氧核糖核酸； 甲基化； 腫瘤診斷； 腫瘤治療； 評述

1 引 言

脫氧核糖核酸（DNA）甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到DNA鏈中特定堿基上的過程。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀遺傳修飾方式之一，常發(fā)生在細(xì)胞的癌變過程中，是研究最為深入的一種表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，是后天性基因沉默的一種重要決定性因素，與染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、外源DNA侵襲時細(xì)胞的自我保護(hù)密切相關(guān)。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤等。在原核生物中，甲基化常發(fā)生在GATC和CCATGG堿基序列中；在哺乳動物中，甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（5′-CpG-3′）的胞嘧啶（C）上，即在MTase作用下，CpG二核苷酸的C轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC），反應(yīng)如下：



高等生物的DNA鏈中有兩種形式的CpG位點(diǎn)： 一種CpG位點(diǎn)分散于DNA鏈中，另一種CpG位點(diǎn)在DNA鏈的某些區(qū)域高度聚集，可達(dá)均值的5倍以上，通常含有20～30個CpG位點(diǎn)，成為C和G的富集區(qū)，這個區(qū)域稱作CpG島。在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島。健康人類基因組中，CpG島中的CpG位點(diǎn)通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在島外的CpG位點(diǎn)則是甲基化的，這種甲基化的形式在細(xì)胞分裂過程中能夠得到保留。大量研究表明，非正常DNA甲基化常發(fā)生在CpG島，能引起染色體結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)；還可使DNA失去限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)及DNA酶的敏感位點(diǎn)，使染色體高度螺旋化、凝縮成團(tuán)、失去轉(zhuǎn)錄活性。另外，甲基化的C可脫氨基生成胸腺嘧啶（T），導(dǎo)致基因置換突變，發(fā)生堿基錯配；如果在細(xì)胞分裂過程中不被糾正，就會誘發(fā)遺傳病或癌癥。CpG島是幼體突變及腫瘤抑制基因失活突變中重要的發(fā)生位點(diǎn)，在人類癌癥中，約有25%的p53基因突變發(fā)生在CpG島；當(dāng)腫瘤發(fā)生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)丟失。因此，研究甲基化形成與改變機(jī)制，建立準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡單的DNA甲基化分析方法，不僅可為某些腫瘤的早期診斷提供線索，還有助于治療甲基化相關(guān)腫瘤新藥物的發(fā)現(xiàn)及篩選。本文綜述幾種重要的DNA甲基化分析方法，著重介紹它們的原理及在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用。

2 DNA甲基化分析方法

根據(jù)分析原理的不同，甲基化分析方法可分為直接測序法、甲基化特異性PCR方法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、熒光法、電化學(xué)方法以及光度分析法等，這些方法可用于檢測基因組整體甲基化水平、分析基因特異位點(diǎn)甲基化程度以及尋找新的甲基化位點(diǎn)等。

2.1 直接測序法

直接測序法是由Frommer等提出的一種DNA甲基化分析方法，其原理是在亞硫酸氫鹽（Bisulfite）作用下，將DNA中未甲基化的C脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），再經(jīng)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶（T），但甲基化的C不發(fā)生脫氨基轉(zhuǎn)化；經(jīng)過處理后，DNA鏈包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為DNA序列的差異；最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并與未處理的序列比較，判斷DNA甲基化水平。Hiltunen等應(yīng)用該方法分析了人類結(jié)腸癌基因中APC基因啟動子區(qū)域的甲基化情況，結(jié)果表明，結(jié)腸癌患者在APC基因啟動子區(qū)域的CpG位點(diǎn)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)。Liu等應(yīng)用該方法對宮頸癌標(biāo)本中的人乳頭瘤病毒（HPV）DNA L1區(qū)序列的甲基化進(jìn)行了研究，由此發(fā)現(xiàn)并檢測到了HPV少見的特殊類型，因此，該方法不僅可以測定甲基化程度，還可提供HPV型別的突變信息。該方法準(zhǔn)確性好、可靠性高，能檢測出目標(biāo)片段中每一個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)；但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣，且耗時。

2.2 甲基化特異性PCR方法

甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR）技術(shù)是Herman等在直接測序法基礎(chǔ)上發(fā)展的一種方法。該方法以亞硫酸氫鹽處理后的DNA產(chǎn)物作模板，加入甲基化特異性的引物或未甲基化的引物進(jìn)行特異性的擴(kuò)增檢測。兩對引物都具有很高的特異性，若用甲基化特異性引物能擴(kuò)增出片段，說明該檢測位點(diǎn)發(fā)生了甲基化；若用未甲基化引物能擴(kuò)增出片段，說明該檢測位點(diǎn)未甲基化。該方法是一種高效、特異、靈敏的DNA甲基化分析檢測方法，并且所需DNA量很少，但不能反映出整個CpG島甲基化程度。

2.3 高效液相色譜及高效毛細(xì)管電泳法

高效液相色譜法（HPLC）和高效毛細(xì)管電泳法（HPEC）是分析DNA甲基化的常用方法，它們都能準(zhǔn)確地定量測定整體DNA甲基化水平。Kuo等首先報道了HPLC方法在測定DNA甲基化方面的應(yīng)用，將DNA樣品經(jīng)酸或酶裂解為堿基，再經(jīng)HPLC分離出各種堿基，通過計算5mC/（5mC＋5C）的面積比可得到整體DNA的甲基化水平。該方法已成為檢測DNA甲基化的標(biāo)準(zhǔn)方法。

鄧大君等對該方法作了進(jìn)一步發(fā)展，他們將變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）與PCR技術(shù)聯(lián)用，發(fā)展了DHPLC方法用于DNA甲基化的分析。將亞硫酸氫鹽處理的DNA產(chǎn)物進(jìn)行差異性擴(kuò)增，處理后的樣品注入到色譜柱中，進(jìn)行梯度洗脫。在合適的變性溫度下，甲基化的DNA在色譜柱中保留的時間比未甲基化的明顯延長，通過比較和分析它們的保留時間可以得到DNA甲基化程度。該方法特別適用于分析構(gòu)成復(fù)雜、同時存在甲基化和非甲基化模板的組織樣品；該方法可獲得DNA一級結(jié)構(gòu)變異的信息，可用于高通量混合樣本檢測，能夠測定整個擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)CpG位點(diǎn)的甲基化，但不能對甲基化CpG位點(diǎn)進(jìn)行精確定位。

與HPLC相比，HPEC方法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。Fraga等用HPEC測定了DNA中5 mC的水平；張敏等用該法檢測了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的DNA甲基化水平，結(jié)果顯示，SLE患者DNA甲基化水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 熒光檢測法

熒光檢測法是由Dennis等提出，并應(yīng)用于p16基因的甲基化水平分析的一種方法。該方法也是先用亞硫酸氫鹽處理待測DNA，然后設(shè)計一個與待檢測區(qū)域互補(bǔ)的探針DNA，探針的5′端連接熒光報告基團(tuán)，3′端連接熒光猝滅基團(tuán)，隨后進(jìn)行實(shí)時定量PCR；在反應(yīng)過程中若標(biāo)記的探針DNA與待測DNA雜交，利用TaqDNA聚合酶的5′到3′端外切酶活性使熒光報告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，開始發(fā)出熒光，測定每個循環(huán)報告熒光的強(qiáng)度即可得到該位點(diǎn)的甲基化情況及程度；若標(biāo)記的探針DNA不能與待測DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點(diǎn)，熒光報告基團(tuán)未受到切割，則不發(fā)熒光。根據(jù)同樣的原理，也可對引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，并通過不同標(biāo)記的組合，檢測多個位點(diǎn)的甲基化水平。Eads等用該方法研究了人類結(jié)腸癌MLH1錯配基因組的甲基化程度，結(jié)果表明，該方法能區(qū)分該基因組中單等位基因和雙等位基因的甲基化情況。楊曉菲等應(yīng)用該方法對原發(fā)性肝癌（HCC）的潛在腫瘤標(biāo)志物MAGE-A1、A3基因異常甲基化改變進(jìn)行了臨床血漿標(biāo)本的檢測，證明了該方法可用于臨床檢測。熒光分析法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重復(fù)性好、分析速率快、所需樣品量少、PCR產(chǎn)物污染少、能實(shí)時監(jiān)測并可對大量的樣本進(jìn)行測定等優(yōu)點(diǎn)，而且可以做多樣本、多基因位點(diǎn)的快速分析；但需要特定熒光探針，測定每個位點(diǎn)都需要一對引物及一條熒光雙標(biāo)記的寡核苷酸探針DNA，且影響因素較多。

目前，該方法得到了進(jìn)一步的發(fā)展。如Worm等提出了甲基化敏感性解鏈曲線分析法（Methylation-specific melting curve analysis），將DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后再用熒光探針標(biāo)記，用熱循環(huán)儀進(jìn)行檢測； 根據(jù)DNA各解鏈區(qū)域?qū)?yīng)的解鏈溫度不同進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，判斷并分析DNA序列中甲基化的水平。一般來說，序列中CG含量越高，對應(yīng)的解鏈溫度越高，而未甲基化序列經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后CG含量降低，熱穩(wěn)定性降低，解鏈溫度降低。Clément等報道了甲基化敏感性斑點(diǎn)分析的新方法（Methylation sensitive dot blot assay），用于定量或半定量分析甲基化水平。該方法是先用亞硫酸氫鹽處理待測DNA片段，隨后以非CG區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用3′端地高辛（DIG）標(biāo)記的含2個CG（或TG）的雙核苷酸探針與DNA雜交，隨后用帶有熒光標(biāo)記的DIG抗體與之反應(yīng)，能與雙CG探針雜交的標(biāo)本是甲基化的，能與TG探針雜交的標(biāo)本是未被甲基化的。因此，可通過比較斑點(diǎn)上熒光的強(qiáng)度分析甲基化水平。文獻(xiàn)\\報道了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)檢測DNA甲基化的方法。該方法以熒光標(biāo)記的脫氧鳥苷三磷酸（dGTP-Fl）為能量供體，陽離子共軛聚電解質(zhì)（CCP-1）為能量受體（CCP-1通過靜電作用與DNA結(jié)合），通過供體與受體的熒光強(qiáng)度比檢測DNA的甲基化水平。他們用該方法分析了從人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中提取的基因組DNA的甲基化水平，DNA用亞硫酸氫鹽處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將探針DNA、引物DNA、Taq酶及熒光標(biāo)記的dGTP-Fl混合，進(jìn)行延伸反應(yīng)。如果待測位點(diǎn)被甲基化，則dGTP-Fl會在反應(yīng)延伸時連結(jié)在引物末端，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，供體的熒光強(qiáng)度減弱，而受體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，再通過分析熒光能量轉(zhuǎn)移率判斷DNA甲基化水平。他們將該方法用于結(jié)腸癌抑癌基因啟動子甲基化水平的分析，為一些癌癥的早期診斷提供了新手段。

2.5 電化學(xué)分析法

由于DNA鏈中的C和mC能發(fā)生電化學(xué)氧化，因此，可以用電化學(xué)方法判斷DNA是否被甲基化及分析DNA甲基化程度。但由于C和mC在結(jié)構(gòu)上很相似，它們的氧化電位很接近， 而且T的氧化電位與C及mC的氧化電位也十分接近，這些都給電化學(xué)方法檢測DNA甲基化帶來困難。Kato等選擇了一個特殊DNA片段，用電子回旋共振納米碳膜電極（Electron cyclotron resonance nanocarbon film electrode）研究了電化學(xué)方法檢測DNA甲基化的可能性，發(fā)現(xiàn)這種電極能使C及mC的氧化峰電位分離達(dá)140 mV之多，并且，由于選擇了一個特殊DNA片段，從而避免了T的氧化干擾；但在DNA序列未知的情況下，這種方法就不能避免T的干擾。最近，Wang等發(fā)現(xiàn)氯化膽堿修飾的多壁碳納米管能催化C及mC的電化學(xué)氧化，并能使C和mC的氧化峰電位分離達(dá)170 mV。根據(jù)堿基配對原則，一條雙鏈DNA中T和腺嘌呤（A）的量是相同的，因此T的電化學(xué)信號可以通過等量A的電化學(xué)加以扣去。據(jù)此，Wang等提出了一種背景扣除法用以消除T的氧化干擾。

還可利用一些電化學(xué)探針分子的電化學(xué)信號變化分析DNA的甲基化。Hou等以典型的抑癌基因p16為研究對象，該基因上包含甲基化敏感性內(nèi)切酶BstU I的酶切位點(diǎn)（5′-CG/CG-3′）。處理后的DNA（提取健康人血清DNA等分兩份（一份經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶修飾，將全部CpG位點(diǎn)甲基化作為陽性樣本； 一份不做任何處理作為陰性樣本）經(jīng)該內(nèi)切酶作用后，未甲基化的DNA被消化成短片段，PCR擴(kuò)增后得不到產(chǎn)物；而甲基化的DNA則保持不變，經(jīng)PCR擴(kuò)增后能得到產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物與固定在金電極表面的探針DNA雜交后與電化學(xué)探針分子\\（ClO4）3發(fā)生嵌入作用，該探針分子只能與雙鏈DNA發(fā)生嵌入作用，不能與單鏈DNA發(fā)生嵌入作用。通過比較該探針分子與DNA作用后的電化學(xué)信號強(qiáng)弱判斷DNA的甲基化程度。該方法結(jié)合PCR技術(shù)能有效快速檢測DNA甲基化，且靈敏度很高，避免了放射性同位素及印記等帶來的麻煩，成本低且結(jié)果可靠。

最近，本研究組提出了一種直接將電化學(xué)探針分子標(biāo)記在探針DNA分子上的電化學(xué)方法用以檢測DNA的甲基化。以羧基二茂鐵（FcA）作為電化學(xué)探針分子，將其通過酰胺鍵與固定在電極表面的探針DNA連接；以抑癌基因p53為研究對象，該基因中含Hpa Ⅱ限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)（5′-C/CGG-3′），該內(nèi)切酶能剪切未甲基化的雙鏈DNA。剪切后，固定在DNA上的FcA分子則脫離電極，導(dǎo)致電化學(xué)響應(yīng)電流減小；甲基化的DNA則不能被剪切，電化學(xué)信號無改變（圖1），因此通過比較Hpa II限制性內(nèi)切酶剪切前后FcA的電化學(xué)響應(yīng)電流即可判斷DNA的甲基化程度。由于FcA的氧化電位接近0 V（vs. SCE），因而可以避免其它氧化物質(zhì)的干擾；該方法還能用于分析甲基化酶的活性以及篩選某些抗癌藥物。

2.6 分光光度分析法

納米材料由于具有獨(dú)特的物理化學(xué)性能以及良好的生物相容性等特點(diǎn)，可作為標(biāo)記物形成生物探針應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域，如金納米粒子（AuNPs）的吸光度與其聚集狀態(tài)有關(guān)，這一特性已被應(yīng)用于DNA的甲基化分析。

Liu等通過AuS將雙鏈DNA修飾到AuNPs上，由于帶負(fù)電荷的DNA之間的相互排斥作用，能使AuNPs均勻分散在溶液中，此時溶液呈紅色；若DNA在MTase作用下被甲基化，再被甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶Dpn I在特定位點(diǎn)5′-GmATC-3′處剪切，導(dǎo)致固定在AuNPs表面的DNA鏈變短，負(fù)電荷減少，在Mg2＋作用下發(fā)生聚集，聚集后的AuNPs呈藍(lán)色（圖2），同時AuNPs的吸光度也隨著狀態(tài)的改變而發(fā)生變化。通過AuNPs顏色及吸光度的變化能有效地判斷DNA是否甲基化及分析甲基化的水平，而且也能分析MTase的活性。該方法具有簡單、快速、無需標(biāo)記、檢出限低等特點(diǎn)，可用于甲基化抑制藥物及某些抗癌藥物的高通量篩選。

2.7 其它分析方法

分析DNA甲基化的方法還有同位素標(biāo)記法，如Gonzalgo等將亞硫酸氫鹽處理DNA并以PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物作為Ms-SnuPE延伸模板，于反應(yīng)體系中加入同位素標(biāo)記的dGTP進(jìn)行甲基化特異的單核苷酸引物延伸，分離后測定同位素放射活性，確定甲基化水平。該方法由于使用放射性的同位素，因而在使用過程中應(yīng)注意放射性防護(hù)。凝膠電泳法，該方法利用甲基化和非甲基化的單鏈DNA具有不同的空間構(gòu)象，在電泳中移動速率不同，出現(xiàn)的位置不同，從而判定待測DNA片段的甲基化水平；高分辨的熔點(diǎn)分析法（High-resolution melting analysis），由于DNA甲基化后能顯著提高熱穩(wěn)定性，根據(jù)這一特性，Rodríguez López等提出了DNA甲基化的熔點(diǎn)分析方法，該方法能靈敏地區(qū)分出只有1個堿基錯配的甲基化DNA；另外， 激光誘導(dǎo)熒光偏振聯(lián)合毛細(xì)管電泳免疫分析法（Laser-induced fluorescence polarization combined capillary electrophoresis immunoassay）以及序列可控的DNA甲基酶分析法（Sequence-enabled DNA mthylase）也已見報道。

3 DNA甲基化分析在腫瘤的診斷和治療中的應(yīng)用

癌癥的早期發(fā)現(xiàn)對癌癥患者的有效治療是非常重要的。研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤中，抑癌基因CpG島發(fā)生高甲基化是基因失活并引發(fā)腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。因此，檢測這些基因的甲基化狀態(tài)可以為相關(guān)腫瘤診斷、治療和預(yù)后評估提供重要參考。基因的甲基化狀態(tài)有望成為腫瘤早期診斷的潛在指標(biāo)，甚至可以作為患病風(fēng)險預(yù)測、臨床病程監(jiān)控和療效評估的指標(biāo)。研究表明，卵巢腫瘤RASSFI A和BRCA1基因甲基化是卵巢腫瘤早期預(yù)兆；Widschwendter等檢測了115例卵巢癌及26例正常卵巢組織標(biāo)本中1號染色體著絲粒及著絲粒旁的衛(wèi)星DNA序列，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中該區(qū)域的衛(wèi)星DNA的甲基化程度增高，且與腫瘤分期、分級及預(yù)后呈正相關(guān)，提示衛(wèi)星 DNA甲基化可作為監(jiān)測卵巢腫瘤預(yù)后的獨(dú)立標(biāo)志物。

DNA甲基化檢測還能以血液、尿液、糞便等為標(biāo)本進(jìn)行，做到早期、非侵入性、無（或低）創(chuàng)傷性的檢查。Chan等應(yīng)用甲基化特異性PCR方法在40例膀胱癌組織標(biāo)本中檢測RASSF1A基因啟動子的甲基化率為47.5% （19/40），并發(fā)現(xiàn)基因甲基化率與病理分級為正相關(guān)關(guān)系，而且RASSF1A基因啟動子甲基化與患者的累積存活率相關(guān)，但與臨床病理分級參數(shù)無顯著相關(guān)性，揭示RASSF1A基因甲基化與膀胱細(xì)胞的癌變有一定關(guān)系。他們還分析了這些患者的尿液脫落細(xì)胞的RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)，其中14例膀胱癌患者尿液脫落細(xì)胞中的RASSF1A甲基化陽性，檢測陽性率為46.7%，而對照組正常人尿液未見陽性。因此， 在尿液中檢測RASSF1A甲基化可能是簡便、無創(chuàng)性、非侵襲性的膀胱癌篩選方法。朱景德對肺癌、卵巢癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、肝癌和結(jié)腸直腸癌進(jìn)行了涉及31個以上基因啟動子區(qū)域CGI的甲基化特異性PCR分析（每種腫瘤不少于69例樣本），發(fā)現(xiàn)19個以上與癌癥分期相關(guān)聯(lián)的基因高甲基化狀態(tài)異常；CDH13， MYOD1， MGMT， p16 INK4a和RASSFlA等基因的高甲基化頻率呈現(xiàn)明顯的腫瘤類型特異性，這為以血漿等體液為樣本進(jìn)行甲基化特異性PCR分析，進(jìn)而判斷腫瘤組織類型提供了理論依據(jù)。

DNA甲基化狀態(tài)是可被逆轉(zhuǎn)的。因此，在腫瘤和癌前病變中通過去甲基化試劑使甲基化的基因去甲基化并重新表達(dá)，可以恢復(fù)某些關(guān)鍵性抑癌基因的功能，從而起到預(yù)防和治療腫瘤的作用。去甲基化藥物5-氮胞嘧啶和5-氮-2′-脫氧胞嘧啶可以抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活性，在一些難治療的腫瘤，特別是白血病治療方面已取得了較好的療效。目前丙戊酸與5-氮雜-2′-脫氧胞苷聯(lián)合用藥治療急性髓系白血病已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。As2O3是砒霜中的主要成分，Cui等的研究表明， 低劑量的As2O3能夠抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，恢復(fù)肝癌細(xì)胞系中p16INK4s、RASSF1A、E-cadherin和GSTP1基因啟動子區(qū)CpG島的部分或全部活性，起到治療肝癌的目的。Uhm等用甲基化特異性PCR法檢測膽管癌、周邊非腫瘤組織、正常肝組織中ID4， DLC21和SFRP1基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果在3種膽管癌細(xì)胞株中檢測到這些基因高甲基化狀態(tài)，而在非腫瘤組織中這些基因檢查率低，并且這些細(xì)胞用5-氮雜-2′-脫氧胞嘧啶處理后基因表達(dá)下調(diào)，說明DNA甲基化異常可能導(dǎo)致膽管癌的發(fā)生，而且DNA甲基化抑制劑可以用于腫瘤的治療。此外，還有抗高血壓藥肼苯噠嗪、抗心律失常藥普魯卡因胺、局部麻醉藥普魯卡因等均可用于DNA去甲基化抗腫瘤的治療。DNA去甲基化藥物將在腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

4 結(jié)束語

DNA甲基化分析技術(shù)的不斷發(fā)展和完善為深一步研究和闡明基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化發(fā)育和基因組印跡以及腫瘤的發(fā)病機(jī)制等提供了有力的工具，對功能基因組學(xué)的研究產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響。典型的DNA甲基化分析技術(shù)主要集中于已知基因序列的甲基化分析，而在基因組水平分析未知序列的甲基化狀態(tài)并尋找與之相關(guān)的新基因是當(dāng)前DNA甲基化分析中的研究熱點(diǎn)。這種研究對于尋找與疾病表觀遺傳學(xué)異常機(jī)制相關(guān)的新的基因及以新的疾病標(biāo)志物都具有重要的應(yīng)用價值。近年來，有研究者提出了以限制性標(biāo)記基因組掃描的全基因組序列特異性甲基化分析新技術(shù)用于未知序列DNA甲基化分析；另外，甲基化敏感的限制性指紋譜、甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增等新技術(shù)的出現(xiàn)為DNA甲基化分析在胚胎發(fā)育、腫瘤細(xì)胞異常基因印記等深層次研究提供了可能。

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Assay Methods of DNA Methylation and Their Applications

in Cancer Diagnosis and Therapy

LIU Shu-Na， TU Yun-Qiu， LI Wen， WU Ping*， ZHANG Hui， CAI Chen-Xin

（Jiangsu Key Laboratory of New Power Batteries， Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials，

Laboratory of Electrochemistry， College of Chemical and Materials Science，

Nanjing Normal University， Nanjing 210046）

Abstract DNA methylation catalyzed by DNA methyltransferase is an important epigenetic event that plays crucial roles in gene transcription and expression， genomic imprinting， embryogenesis， and maintaining normal cell function. Aberrant DNA methylation can lead to the development of cancer. Therefore， an approach for the rapid， facile， and sensitive detection DNA methylation could provide a powerful tool for early cancer disgnosis. This paper reviews the assay methods of DNA methylation. Specifically， direct sequencing， methylation-specific PCR， high performance liquid chromatographic method， capillary electrophoresis， fluorescence approach， electrochemical apparoach， and colorimetric approach are presented. In addition， the application of the assay of DNA methylation in cancer diagnosis and therapy is summarized. Finally， the further development on the assay methods of DNA methylation and their applications are briefly introduced.

Keywords Deoxyribonucleic acid; Deoxyribonucleic acid methylation; Cancer diagnosis; Cancer therapy; Review

（Received 17 January 2011; accepted 3 May 2011）