魚鰾膜為基質的生物傳感器測定葡萄糖的研究

摘 要 以魚鰾膜為基質固定葡萄糖氧化酶，偶聯氧電極，構建了葡萄糖生物傳感器，通過測定溶解氧濃度的變化定量測定葡萄糖。考察了酶濃度、pH值、緩沖液濃度對傳感器的影響，優化了實驗條件：即酶濃度為1 mg， pH 7.0，緩沖液濃度為100 mmol/L。此傳感器具有較寬的線性范圍（0.016～1.2 mmol/L），較短的響應時間（70 s），較低的檢出限（8 mol/L），良好的重復性（2.5%， n＝10）和重現性（1.2% ， n＝3），連續使用200次后響應信號能保持95%以上； 3個月后響應信號為初始值的88.5%。此傳感器已成功應用于人血清中葡萄糖含量的測定，測定結果與市售試劑盒法獲得的結果相一致。回收率為95.2%～106.3%。

關鍵詞 葡萄糖傳感器； 魚鰾膜； 葡萄糖氧化酶

1 引 言

葡萄糖的定量測定在臨床醫學、生物化學、食品科學等領域有極其重要的作用。健康人體中空腹血糖濃度的正常范圍為3.89～5.83 mmol/L，血糖濃度持續偏高，是發生某些疾病征兆，如糖尿病、高血糖癥等。葡萄糖的測定方法有色譜法、光譜法和毛細管電泳法等，而這些方法有的需要復雜的前處理過程，有的儀器設備成本高。生物傳感器法由于具有檢測速度快、選擇性好、體積小、易操作等優點，得到了廣泛應用。

生物傳感器包括酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、基因傳感器、細胞及細胞器傳感器等。在葡萄糖傳感器的研究中，酶傳感器研究最廣，它基于葡萄糖氧化酶的催化氧化反應，反應式如下式：

葡萄糖（Glucose）＋Ｏ２葡萄糖氧化酶Glucose oxidase葡萄糖酸（Glucose acid）＋2H2O2（1）

葡萄糖氧化酶的固定化是構建葡萄糖傳感器的重要環節。固定酶的載體可采用無機材料、有機高分子膜及天然生物材料等。天然膜材料（雞蛋膜、竹腔內膜、洋蔥內膜等）具有生物相容性好、無毒等優點，已被用于固定葡萄糖氧化酶。但這些膜材料的機械強度差，限制了葡萄糖生物傳感器的應用。

魚鰾膜具有良好的透氣性和透水性，價廉易得，機械強度高且韌性好，可以為酶的固定化提供優良的生物基質。本研究基于溶解氧電極，采用天然的生物材料魚鰾膜和交聯劑戊二醛、包埋劑殼聚糖，構建了新型的葡萄糖生物傳感器。對影響因素進行了優化，建立了新型葡萄糖分析測試方法，并成功應用于血液中葡萄糖含量的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Pasco CI-6542溶解氧傳感器（15 cm ×10 cm × 5 cm， Pasco Scientific， Roseville， CA）； pHS-3C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）; 恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）; TU1901紫外可見分光光度計（北京普析儀器公司）; L600低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

葡萄糖氧化酶（酶活力為273 Units/mg，Sigma公司）; β-D-葡萄糖（Acros Organics公司）; 殼聚糖（脫乙酰度75%～85%，Sigma公司）; 葡萄糖試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）; 新鮮魚鰾膜;Na2HPO4-NaH2PO4（pH 7.0），Na2HPO4-NaOH和NaH2PO4-HCl緩沖溶液。血樣由山西大學校醫院提供，其它試劑均為分析純。實驗用水為蒸餾水。

2.2 血樣的處理

新鮮血樣加入抗凝劑肝素后，以4000 r/min離心5 min，靜置分層，用吸管將上清液吸出，置于另一試管中，加蓋保存到4 ℃冰箱中備用。

2.3 酶膜的制備

取新鮮魚鰾一個，依次用自來水和蒸餾水沖洗，在頂端處剪開一缺口，鋪開置于潔凈的表面皿中，小心截取一個直徑為1.5 cm的圓形膜。在膜上滴加50 L 0.3%（w/V）殼聚糖溶液，15 min后滴加50 L 2.0%（w/V）葡萄糖氧化酶溶液， 晾至稍干后再滴加10

L交聯劑10%（V/V）戊二醛溶液，室溫放置2 h，置于冰箱中冷藏過夜。用100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）沖洗數次，以便將未固定的酶及多余的包埋劑和交聯劑洗掉。制得的酶膜浸泡在100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）中，置于4 ℃冰箱中保存備用。

2.4 測定方法

將制備好的酶膜緊貼于溶解氧電極的表面，即成酶電極，將此酶電極浸入5 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）中，在均勻攪拌條件下加入一系列葡萄糖標準溶液（0.05 mol/L）和待測溶液，用Workshop 500軟件記錄溶解氧濃度的下降值，從而求得葡萄糖溶液的濃度。

3 結果與討論

3.1 傳感器的響應特性

將電極浸入5 mL100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）中，在攪拌條件下加入不同濃度的葡萄糖標準溶液。隨著葡萄糖溶液的加入，

傳感器產生一系列的響應，如圖1所示。隨著葡萄糖濃度的增加，溶解氧下降值增大，這是葡萄糖濃度定量分析的基礎。葡萄糖濃度C （mmol/L）和溶解氧濃度下降值Y（mg/L）之間的線性關系為Y＝7.33662C－0.16732， R＝0.9998，如圖1插圖。

3.2 實驗條件的優化

3.2.1 固定酶濃度的影響 酶的活性的高低直接影響酶所催化反應的速率，固定時所用酶溶液的濃度會影響電極表面固定的酶量，從而影響傳感器的響應信號。本實驗制備了5張酶膜， 固定化酶所用的酶濃度依次為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%（w/V），連接溶解氧裝置，考察固定酶濃度對傳感器響應的影響。

在5 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）中，加入50

L 0.05 mol/L葡萄糖標準溶液，記錄溶解氧濃度響應曲線（圖2）。 結果表明，隨固定酶濃度的增加（0.5%～2.0%），響應信號增強，但當酶濃度大于2.0%時，信號增強幅度變小，所以固定酶濃度選取2.0%。

3.2.2 戊二醛濃度的影響 戊二醛作為交聯劑，它的濃度也會影響傳感器的響應行為，在5 mL緩沖溶液中加入適量葡萄糖標準溶液，記錄溶解氧濃度下降曲線。結果表明，隨戊二醛濃度的增大（5%～20%，V/V），響應信號同時增強；當戊二醛濃度為20%時，響應達到最大值。這是由于高濃度的戊二醛會抑制酶活性， 從而引起響應信號的降低。本研究中戊二醛濃度選取20%（V/V）。

3.2.3 pH值的影響 取固定酶濃度為2.5%（w/V）， 戊二醛濃度為20%的魚鰾膜，依次以pH 5.0， 6.0， 7.0， 8.0和9.0的磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L）為底液，考察了pH值對傳感器的影響。 圖2 固定酶濃度的影響

Fig．2 Effect of enzyme loading

加入酶濃度（Enzyme concentration，%）：（1） 0.5; （2） 1.0; （3） 1.5; （4） 2.0; （5） 2.5。Error bars are 95% confidence internals calculated from three replicate measurements.

在5 mL底液中加入適量葡萄糖標準溶液，記錄溶解氧濃度的響應曲線。結果表明，響應信號與pH值呈現“鐘”型曲線；在pH＝7.0時，響應信號最大；當pH＜6.0或pH＞8.0時，響應值明顯降低。這是由于過酸或過堿的底液會破壞酶的結構， 使之活性降低，進而導致傳感器靈敏度下降。本實驗選取pH＝7.0。

3.2.4 緩沖液濃度的影響 選取一系列濃度（25， 50， 100， 200， 300和400 mmol/L）磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）， 在5 mL 上述底液中加入適當葡萄糖標準溶液，記錄溶解氧濃度下降曲線。結果表明，隨著緩沖液濃度的增加，響應信號增強，但相應的響應時間也增長。考慮到測定速度，后續實驗選取緩沖液濃度為100 mmol/L。

3.3 線性范圍、檢出限、響應時間、重復性及重現性

本傳感器的葡萄糖濃度在0.016～1.2 mmol/L內呈現良好的線性關系; 檢出限為8

mol/L （3σ）; 響應時間以從加樣到溶解氧濃度值達到穩定值95%時的時間計算，平均響應時間為70 s。

對同一張酶膜加入0.2 mmol/L葡萄糖溶液，重復測定10次，響應信號的RSD為2.5%，說明此傳感器有良好的重復性；采用3張不同的酶膜，分別加入0.02 mmol/L葡萄糖溶液， 響應信號的RSD為1.2%， 說

3.4 傳感器的壽命

本葡萄糖生物傳感器在同一張酶膜上對葡萄糖連續測試200次，響應信號仍能達到初始值的95%以上；若存放于4 ℃冰箱中，每隔3～4 d重復檢測0.2 mmol/L葡萄糖溶液的響應值，3個月后響應信號為初始值的88.5%。

3.5 葡萄糖傳感器的干擾的測定

本實驗選取血樣為測定對象，考察了血樣中可能存在的干擾物質對測定結果的影響（表1）。結果表明，血液中存在的常見物質對葡萄糖的測定幾乎無影響。

3.6 樣品分析

取100

L處理好的血清，加入5 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7），連接溶解氧裝置，進行測定；在各樣品中分別加入5.55 mmol/L葡萄糖標準溶液，進行回收率測定（表2）， 回收率在95.2%～106.3%之間；用試劑盒法進行對照，兩種方法所得結果吻合。

4 結 論

本研究制備的基于魚鰾膜固定葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物傳感器具有響應間短、線性范圍寬、操作簡單、壽命長等優點，并已成功應用于人體血液中葡萄糖的測定，測定結果與試劑盒一致，獲得了較為滿意的結果。說明本實驗構建的以魚鰾膜為基質的葡萄糖生物傳感器可以為血液中葡萄糖的測定提供一種簡便、快速、精確的方法。

References

1 Wang J. Electroanalysis， 2001， 13（12）: 983～988

2 DONG Xiao-Dong， HOU Wan-Ling， SU Shao-Zhe， ZHANG Yu-Bin（董曉東， 侯宛玲， 蘇紹哲， 張玉彬）. Chinese J．Anal. Chem.（分析化學）， 2000， 28（5）: 656

3 WU Ling-Li， ZHANG Huan-Huan， LI Quan-Min（吳伶俐， 張歡歡， 李全民）. Chinese J．Analysis Laboratory（分析試驗室）， 2009， 28（3）: 85～88

4 Kuci Z， Hins J， Kuci S. J. Biochem. Biophys. Methods， 2006， 69（1-2）: 79～87

5 XIONG Zhi-Gang， LI Jian-Ping， TANG Li， CHEN Zhi-Qiang（熊志剛， 李建平， 唐 麗， 陳志強）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（6）: 800～804

6 Quinto M， Losito I， Palmisano F. Anal. Chim. Acta， 2000， 420: 9～17

7 Lomillo M A A， Ruiz J G， Pascual F J M. Anal. Chim. Acta， 2005， 547（2）: 209～214

8 ZHU Yu-Nu， PENG Tu-Zhi， LI Jian-Ping（朱玉奴， 彭圖治， 李建平）. Chinese J. Anal. Chem．（分析化學）， 2004，32（10）: 1299～1303

9 TANG Fang-Qiong， WEI Zheng， CHEN Dong， MENG Xian-Wei， GOU Li， RAN Jun-Guo（唐芳瓊， 韋 正， 陳 東， 孟憲偉， 茍 立， 冉均國）. Chem. Chinese University（高等學校化學學報）， 2000， 21（1）: 91～94

10 Wu B， Zhang G， Zhang Y， Shuang S， Choi M M F. Anal. Biochem.， 2005， 40（1）: 181～183

11 YANG Xiao-Feng ， ZHOU Zai-De ， QIAO Li-Na， XIAO Dan（楊曉鳳， 周在德， 喬麗娜， 肖 丹）. Chinese J. Chemical Sensors（化學傳感器）， 2005， 25（3）: 61～66

12 Kumer J， D′Souza S F. Biosens. Bioelectron， 2009， 24: 1792～1795

13 Pozzo A D， Vanini L， Fagnoni M， Benedittis A， Muzzarelli R A A. Carbohydrate Polym.， 2000， 42: 201～206

A Biosensor Based on Swim Bladder Membrane as

Substrate for Determination of Glucose

JIA Wen-Juan， CUI Miao， ZHANG Yan， SHUANG Shao-Min*

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006）



Abstract A glucose biosensor based on the swim bladder immobilized glucose oxidase has been deve-loped. The glucose concentration was quantified by the decrease of dissolved oxygen. The effects of enzyme loading， pH， buffer concentration and interference were studied. When the enzyme concentration was 2.0%， pH was 7.0， and the buffer concentration was 100 mmol/L， the biosensor showed a maximum response. The biosensor showed a wide linear response with a concentration range of 0.016－1.2 mmol/L， fast response time （70 s）， good repeatability （2.5%， n＝10） and satisfactory reproducibility （1.2%， n＝3）. The biosensor retained 88.5% of its initial response after 3 months， and the immobilized enzyme retained its 95% activity after 200 times used. The proposed biosensor method was successfully applied to the determination of glucose concentration in human blood serum， and the results were agreement with that obtained from a colorimetric assay kit method. The recoveries were between 95.2% and 106.3%.

Keywords Glucose biosensor; Swim bladder; Glucose oxidase

（Received 22 November 2010; accepted 14 March 2011）