高效液相色譜與液相色譜-質(zhì)譜分析冬蟲夏草相關產(chǎn)品之麥角固醇與其衍生物

摘 要 采用HPLC與LC-MS分析西藏冬蟲夏草（Cordyceps sinensis， Cs）子實體、Cs分離的無性世代中國被毛孢（Hirsutella sinensis）菌絲體（Hsm）RS6-3、市售蛹蟲草（Cordyceps militaris， Cm）和蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali， Cs-4）中所含的麥角固醇與其衍生物。結(jié)果表明: Cs子實體子座的麥角固醇比菌核高約3倍，含量約為0.92 g/L，且該子座含2種H1-A衍生物；本實驗室所分離的Hsm RS6-3含有5種H1-A衍生物；但Cs子實體菌核、Cm和Cs-4均不含有H1-A衍生物。本研究為蟲草相關產(chǎn)品的質(zhì)量檢測提供了技術支持。

關鍵詞 冬蟲夏草； 中國被毛孢； 蛹蟲草； 蝙蝠蛾擬青霉； 麥角固醇衍生物; 高效液相色譜; 液相色譜-質(zhì)譜

1 引 言

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis （Berk.） Sacc.，Cs），由僵硬的喜馬拉雅鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲蟲草的蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus Oberthur）幼蟲的頭頂長出菌柄（Stipe）和子座（Stroma），最終形成一個狼牙棒的子實體 。本實驗室于1999年從Cs子實體中分離出來無性世代中國被毛孢菌絲體（Hirsutella sinensis mycelium， Hsm），并獲分子生物鑒定其基因而確認。

Cs因可治療肺與腎臟等疾病而受到關注。麥角固醇（ergosterols）及其衍生物具有細胞毒素活性、抗病毒與抗心律不整等藥理功效，而Cs特有的麥角固醇衍生物H1-A甚至可抑制已活化的人類腎絲球腎膈細胞（Activated human mesangial cells）及改善A型免疫球蛋白腎病（Immunoglobulin A nephropathy）。

本研究采用HPLC分析西藏的Cs子實體分離的Hsm RS6-3、市售蛹蟲草（Cordyceps militaris， Cm）和蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali， Cs-4），對甲醇提取液中二次代謝產(chǎn)物進行層析圖譜分析，探討其LC-MS/MS的分析條件，尋找蟲草甲醇提取液中麥角固醇及其衍生物H1-A相關二次代謝產(chǎn)物，為蟲草相關產(chǎn)品的質(zhì)量檢測提供技術支持。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Cs子實體（西藏）；Cm（臺灣萬生生技公司）與Cs-4菌絲體粉末（煙臺瑞東科技發(fā)展公司）；馬鈴薯葡萄糖肉汁培養(yǎng)液（PDB）及其洋菜培養(yǎng)基（PDA）購自美國Acumedia公司；蛋白胨（美國Difco公司）。麥角固醇標準品（美國Sigma公司）；甲醇（HPLC級，德國Merck公司）；實驗用水均經(jīng)過Milli-Q的純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）處理。

2.2 菌株的培養(yǎng)與保存

本研究室從Cs子實體中分離出無性世代菌株Hsm RS6-3，接種于PDA的斜面試管中，以（15±0.5）℃進行種菌培養(yǎng)，每隔4～6個月移殖至新鮮PDA斜面試管中培養(yǎng)，以此進行菌種的培養(yǎng)與保存。

2.3 實驗用菌株的培養(yǎng)準備

以無菌接種鉤勾取面積約0.5～1 cm2的菌絲體，移植到含有PDA的平板中，并于（15±0.5）℃培養(yǎng)2個月，再以無菌接種鉤勾取面積約0.5～1 cm2的菌絲體，移植到含有150 mL PDB的500 mL搖瓶中，在轉(zhuǎn)速80 r/min，（15±0.5） ℃條件下。搖瓶振蕩培養(yǎng)2個月。

2.4 HPLC的分析條件

L-2130 HTA型HPLC系統(tǒng)，配L-2420型UV-visible檢測器（日本Hitachi公司）；Thermo C-18 Gold色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5

m， 澳大利亞Thermo公司）；柱溫40 ℃；進樣量為20

L；流動相為甲醇-水（9∶1， V/V）；采等度洗脫方式；流速0.67 mL/min；檢測波長280 nm。

2.5 樣品的前處理

將Cs子實體切割分成子座（Stroma）與菌核（Sclerotium）兩部份，并凍干以備使用；培養(yǎng)2個月的Hsm RS6-3，在4 ℃，以6000 r/min離心15 min，獲取其菌絲體部份，以超純水清洗兩次并凍干，備用；Cm與Cs-4菌絲體的粉末亦于使用前凍干。

2.6 HPLC分析樣品的總麥角固醇

在0.1 g經(jīng)干燥并研磨成粉末的樣品中，加入10倍體積的甲醇，并于冰浴中超聲振蕩10 min；以10000 r/min離心5 min，收集上清液；其沉淀物再加入10倍體積的甲醇重復提取及離心，合并上述上清液；以0.22

m濾膜（美國Sigma公司）過濾；取20

L濾液進行HPLC分析。麥角固醇的標準溶液濃度為2， 5， 10， 50， 100， 300， 500， 800和1000 mg/L。上述分析均重復至少3次。

2.7 LC-ESI-MS分析麥角固醇類與其衍生物H1-A

液相層析部分是使用Finnigan Surveyor Plus 液態(tài)層析系統(tǒng)（美國Thermo公司）；Thermo C-18 Gold色譜柱（125 mm×4.6 mm i.d.， 5

m，澳大利亞Thermo公司）；柱溫 40 ℃；進樣量 20

L；流動相為甲醇-水（9∶1， V/V）；采用等度洗脫方式；流速80.4

L/min；檢測波長280 nm。一級質(zhì)譜條件使用液態(tài)層析系統(tǒng)串聯(lián)Finnigan LCQ DECA 質(zhì)譜光譜檢測儀（美國Thermo公司）并配電噴霧離子源（Electrospray ionization; ESI）與離子阱（Ion trap）的質(zhì)譜分析儀；ESI采用正電荷電離模式；離子進料毛細管溫度350 ℃；毛細管電壓4.7 kV；輔助氣體（Auxiliary gas）流速：3 arbitrary units；剝除溶劑氣體（Sheath gas）流速：5 arbitrary units；全掃描檢測模式（Full scan mode） 100～2000 amu；掃描寬度（m/z）0.5；掃描時間：0.5 s；電噴霧電壓（Spray voltage）：5.0 kV；所有的數(shù)據(jù)擷取與分析皆使用Xcalibur software， v 2.0.7軟件。

2.8 二級質(zhì)譜鑒定麥角固醇類與其衍生物H1-A

使用MS/MS監(jiān)控模式記錄所有的LC-MS/MS數(shù)據(jù)。質(zhì)譜分析儀的離子阱捕捉總離子（Total ion trapping）和子離子（Daughter ions）；母離子（Parent ion）選擇通道m(xù)/z 0.5 span和離子阱通道開關延遲0.02 s；母離子麥角固醇和H1-A利用電場達分離；以常態(tài)化碰撞能量（Normalized collision energy）碰撞母離子麥角固醇和H1-A以碎裂形成子離子；所有的數(shù)據(jù)擷取與分析皆使用Xcalibur software， v 2.0.7軟件； 成分結(jié)構(gòu)與其片段的預測、模擬與分析則皆使用Massfrontier和ChemBioDraw軟件。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC進行提取液中麥角固醇類的定性與定量分析

為建立最佳層析條件，對HPLC參數(shù)，包括流動相（甲醇-水或乙腈-水）、色譜柱（Hypersil Gold a Q column， （250 mm×4.6 mm， 5

m）；Hypersil GOLD C8 column （250 mm×4.6 mm， 5

m）；Hypersil Gold column（150 mm×4.6 mm， 5

m）；Lichrospher RP-18 endcapped column （250 mm×4.6 mm， 5

m）、柱溫（30， 35或40 ℃）和流動相流速（0.5～1.0 mL/min）進行了考察。麥角固醇標準品濃度的線性范圍為2～1000 mg/L，麥角固醇標準品的HPLC保留時間為24.6～24.9 min。麥角固醇的線性方程為y＝29480x＋66130，相關系數(shù)（R）為0.9987，其中y為分析物的平均峰面積，x是分析物的濃度。

HPLC結(jié)果顯示，Cs子實體、Hsm RS6-3， Cm和Cs-4的甲醇提取液中代謝產(chǎn)物的保留時間為14～36 min（圖1）。Cs子座、Cs菌核、Hsm RS6-3、Cm和Cs-4甲醇提取液中麥角固醇的相對含量為0.92， 0.30， 3.60， 0.04和2.15 g/L（圖1）；其中Hsm RS6-3的甲醇提取液中的麥角固醇含量最高，且Cs子座的甲醇提取液中的麥角固醇含量比為Cs菌核高約3倍（圖1）。

3.2 甲醇提取液中的H1-A與其衍生物的鑒定

在全LC-MS 掃描模式下，Cm 和Cs-4的甲醇提取液均不含有m/z 410.3±1信號，證實Cm 和Cs-4不含H1-A及其衍生物；但Cs子實體與Hsm RS6-3的甲醇提取液中可見的H1-A與其衍生物信號m/z 410.3±1（圖2）。Cs子座的甲醇提取液中含有2個H1-A相關衍生物JH-1和JH-2（即m/z 411.35和411.32）（表1），LC保留時間約為15.87和26.42 min（表1）。Hsm RS6-3則含有5個H1-A相關衍生物LC-1， LC-2， LC-3， LC-4和LC-5（即m/z 410.33， 410.97， 409.32， 410.63和410.32，表1），LC保留時間約為16.83， 35.58， 40.18， 49.06和55.67 min。

圖1 麥角固醇標準溶液， 冬蟲夏草子實體Cs， 中國被毛孢菌絲體Hsm RS6-3， 蛹蟲草Cm和蝙蝠娥擬青霉Cs-4菌的甲醇提取液成分的HPLC層析圖

Fig．1 HPLC chromatograms of the components in methanol soluble fraction of ergosterol standard， Cordyceps sinensis （Cs） fruiting bodies， Hirsutella sinensis mycelium RS6-3 （Hsm RS6-3）， C. militaris （Cm）， and Paecilomyces hepialid （Cs-4）

麥角固醇標準品在LC-MS/MS分析中的保留時間約為54.55 min（表1）。在ESI（＋）電離模式掃描下麥角固醇的母離子均為［M＋H］＋（m/z 379.2±1），經(jīng)35%常態(tài)化碰撞能量碰撞麥角固醇的母離子碎裂成子離子，其相對的麥角固醇子離子為m/z 364， 309， 294， 239和185（表1、表2和圖3），每種成分的結(jié)構(gòu)圖見圖3。同樣，在ESI（＋）電離模式掃描下，依據(jù)LC-MS/MS結(jié)果，Cs子座的甲醇提取液中含有的2個H1-A相關衍生物JH-1和JH-2（表1、圖4），二級質(zhì)譜圖顯示其具有的主要片段為m/z 350±1，其相對應的結(jié)構(gòu)為（10R，13R）-17-（（S，E）-hex-3-en-2-ylium-5-yl）-10，13-dimethyl-7-oxo-2，3，4，7，9，10，11，12，13，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta\\phenanthren-3-ylium（表2、圖4）；Hsm RS6-3的甲醇提取液中含有5個H1-A相關衍生物LC-1， LC-2， LC-3， LC-4和LC-5（表1， 圖5），二級質(zhì)譜顯示其具有相同的子離子（m/z 254±1和393±2），其相對應的結(jié)構(gòu)分別為（13S）-13-methyl-9，10，11，12，13，15，16，17-octahydro-

1H-cyclopenta\\phenanthren-7（2H）-one和（3aR，6R）-6-allyl-3-（（2R，5R，E）-5，6-dimethylhept-3-en-2-yl）-3a，6，7-trimethyl-9-methylene-2，3，3a，4，5，5a，6，9-octahydro-1H-cyclopenta\aphthalene（表2， 圖5）。

4 結(jié) 論

本研究表明。Cm和Cs-4的甲醇提取液均不含有H1-A相關衍生物，但Cs子實體與本實驗室所分離的Hsm RS6-3甲醇提取液含有7個分子量相似的H1-A相關衍生物，它們的母離子為m/z 410±1；二級質(zhì)譜顯示，Hsm RS6-3甲醇提取液中含有H1-A相關衍生物LC-3和LC-5，具有與麥角固醇標準品相同的子離子（m/z 294和364）外，彼此具有相同的子離子（m/z 191和395），且子離子m/z 191和395已經(jīng)文獻鑒定證實為H1-A的子離子，因此證實LC-3和LC-5可以是麥角固醇與H1-A的相關衍生物。其它成分，如LC-1和LC-2也具有與H1-A相同的母離子與分子量（m/z 410±1），且具有與麥角固醇標準品相同的子離子（m/z 239和364），因此證實LC-1和LC-2也可以是麥角固醇與H1-A的相關衍生物。

建立了HPLC和LC-MS/MS分析Cs及Hsm RS6-3的二次代謝物的方法，可用于評估蟲草相關產(chǎn)品的真?zhèn)渭百|(zhì)量。此外，由于LC-MS/MS比較分析結(jié)果和Massfrontier及ChemBioDraw軟件的仿真片段吻合較好，發(fā)現(xiàn)了7種H1-A相關衍生物，將對這些化合物進行純化與分析，以了解它們化學結(jié)構(gòu)及藥理特性。

致 謝 屏東科技大學活性天然物技術研發(fā)中心（Research Center for Bioactive Products， National Pingtung University of Science and Technology）提供HPLC和LC-ESI-MS/MS儀器協(xié)助研究。

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Determination of Ergosterol and Its Derivatives in Cordyceps Sinensis-

associated Products by High Performance Liquid Chromatography

and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

CHEN Lin-Cheng1， HSEU Ruey-Shyang1， GUO Jia-Hsin*2

1（Department of Biochemical Science and Technology， College of Life Science， Taiwan University， Taipei 10617）

2（Department of Food Science， College of Agriculture，

Pingtung University of Science Technology， Pingtung 91201）



Abstract Current research uses HPLC and LC-MS to investigate ergosterol and its derivatives contained in a Cordyceps sinensis （Cs） fruiting body obtained from Tibet， an anamorphic Hirsutella sinensis mycelium （Hsm） strain RS6-3 isolated from Cs by our laboratory， and some Cs-associated products， such as Cordyceps militaris （Cm） and Paecilomyces hepialid （Cs-4）. Results indicated that the ergosterol in the Cs stroma was approx. 0.92 g/L， or about 3 times higher than that found in the sclerotium. The Cs stroma contained 2 kinds of H1-A derivatives， while the Hsm RS6-3 contained 5 kinds of H1-A derivatives， which were different from those found in the Cs sclerotium. No H1-A derivative was found in Cs sclerotium， Cm or Cs-4. The results of this investigation may provide a technical foundation for assessing the quality of Cs-associated products.

Keywords Cordyceps sinensis; Hirsutella sinensis; Cordyceps militaris; Paecilomyces hepiali; Ergosterol derivatives; High performance liquid chromatography; Liquid chromatography-mass spectrometry

（Received 13 February 2011; accepted 27 May 2011）