二醋酸纖維素-離子液體膜固定肌紅蛋白制備過氧化氫傳感器

摘 要 將二醋酸纖維素（CDA）-（1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體）（\\BF4）-肌紅蛋白（Mb）的復合物修飾在玻碳電極（GCE）表面，制備了一種新型Mb修飾電極（CDA-\\BF4-Mb/GCE）。光譜分析表明: 固定在CDA-\\BF4-Mb膜中的肌紅蛋白保持了其天然構象和生物活性。離子液體促進了CDA-\\BF4-Mb膜中的電子轉移， 極大地提高了修飾電極的導電率。Mb修飾電極對過氧化氫的還原具有明顯電催化作用， 其表觀米氏常數Km為1.758×10－4 mol/L； 催化電流與過氧化氫的濃度在5.0～100

mol/L范圍內呈線性關系； 檢出限為2.0

mol/L（S/N＝3）。

關鍵詞 肌紅蛋白; 二醋酸纖維素; 離子液體; 過氧化氫; 電催化

1 引 言

研究蛋白質和酶的電催化過程，對于認識重要生命物質在生命體內的代謝過程具有重要意義。目前，用于制備肌紅蛋白（Mb）修飾電極的材料主要有透明質酸、介孔分子篩、碳納米管、金屬氧化物、黏土等。如何開發更為有效的固定蛋白質的途徑， 是當前酶電極研究的熱點。纖維素作為一種環境友好型高分子材料， 具有良好的可成膜性、生物相容性及生物降解性而被應用于蛋白質和酶的固定。二醋酸纖維素（Cellulose diacetate， CDA）是纖維素衍生物中最早進行商品化生產， 并且不斷發展的纖維素有機酯， 但在蛋白質及酶的固定化方面的應用比較少見。因此，這方面的研究具有重要意義。CDA導電性較差，限制其在電催化的應用，故用作蛋白質固定化時需加入電位窗口寬、導電效率高和溶解能力好的離子液體。

本研究以CDA-\\BF4 （1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體） 復合膜將肌紅蛋白（Mb）固定于玻碳電極（GCE）表面， 采用紫外-可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡及電化學交流阻抗法對包埋于膜內的Mb進行了表征， 利用i-t曲線法研究了修飾電極對H2O2的電催化性能， 為氧化還原蛋白的固定化以及電化學傳感器的構建提供了一種新的生物兼容性材料。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI832電化學工作站（上海辰華儀器公司）; 三電極體系， 工作電極為修飾玻碳電極（Φ＝3 mm）， 參比電極為飽和甘汞電極， 輔助電極為鉑絲電極; SB4200DTD超聲波清洗機（寧波新芝公司）; Nicolet Evolution 300紫外-可見分光光度計（英國）; JEOL JSM-5800掃描電鏡（SEM）， 加速電壓為15 kV。

肌紅蛋白（Mb， wolsen）， 實驗中用pH＝7.0的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配成 5.0 g/L的Mb溶液;二醋酸纖維素（CDA， 陜西師范大學化學與材料科學學院提供）; 30% H2O2（西安化學試劑廠）;緩沖溶液為pH＝7.0的PBS溶液， 實驗用水為二次蒸餾水， 其它試劑均為分析純。電化學測定前均先通高純氮氣除去研究溶液中的溶解氧， 并維持在氮氣氣氛下測定。

2.2 \\BF4的合成

將 0.3 mol N-甲基咪唑和 0.33 mol溴代正丁烷加入250 mL圓底燒瓶中， 于70 ℃攪拌反應3 h， 得到\\Br。將上述產物溶于100 mL丙酮中， 加入 0.3 mol NaBF4， 室溫攪拌反應5 h；反應結束后， 將產物抽濾， 去除NaBr固體；濾液旋轉蒸發去除丙酮， 冷卻至室溫， 析出白色NaBr晶體， 上層為黃色液體；抽濾， 加入CH2Cl2使得NaBr固體充分析出；在 70 ℃下真空干燥24 h， 得到離子液體\\BF4。產物經FTIR和1HNMR分析確認， 純度通過HPLC分析。

2.3 CDA-\\BF4-Mb/GCE修飾電極的制備

玻碳電極先用0.05

m的Al2O3拋光成鏡面， 再依次用HNO3（1∶1， V/V）、無水乙醇及水分別超聲清洗5 min。

準確稱量7.0 mg CDA溶解于1.00 mL丙酮中，得7.0 g/L CDA溶液；向其中加入0.02 mL \\BF4離子液體， 充分搖勻即得\\BF4-CDA混合液。用微量進樣器依次取2

L Mb溶液（5.0 g/L）及1

L \\BF4-CDA混合液，滴加到清洗好的玻碳電極表面， 在4℃下晾干5 h，得到的電極記為CDA-\\BF4-Mb/GCE。電極不用時，浸沒于PBS溶液（pH＝7.0）中，于4 ℃冰箱中保存。

2.4 實驗方法

采用三電極系統: 酶修飾電極為工作電極、鉑絲為對電極、飽和甘汞電極為參比電極。選取PBS（0.01 mol/L， pH＝7.0）為工作底液，掃速為150 mV/s，室溫（25 ℃）條件下進行CV測試，記錄CDA-\\BF4-Mb/GCE對H2O2的安培響應。

3 結果與討論

3.1 CDA-\\BF4-Mb的光譜研究

血紅素類蛋白質在408 nm左右的Soret 吸收帶（圖1）可作為判斷其變性的重要標志。為了考察CDA-\\BF4的生物兼容性， 分別測定了Mb和CDA-\\BF4-Mb混合物的紫外-可見吸收光譜。從圖1可見， 天然Mb的最大吸收峰位于409 nm （曲線a）， CDA-\\BF4-Mb混合物的最大吸收位于412 nm（曲線b）， 吸收峰的位置略有紅移；同時， 吸光度有所降低， 說明Mb與CDA-\\BF4發生了作用。Lei等認為這是由CDA-\\BF4復合物的表面勢能及其吸光性質決定的， 但這并不會影響Mb血紅素周圍肽鏈的結構及其狀態。因此， 在CDA-\\BF4溶液中，Mb仍然保持了相應的生物活性。

分 析 化 學第39卷

第9期董社英等: 二醋酸纖維素-離子液體膜固定肌紅蛋白制備過氧化氫傳感器

蛋白質的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ基團的紅外吸收帶能夠提供多肽鏈二級結構的信息。在Mb的FT-IR光譜中（圖2a），出現在1632和1589 cm－1處的吸收峰分別為Mb中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰。酰胺Ⅰ是由于肌紅蛋白肽鏈骨架中的肽段連接處C＝O的伸縮振動引起的；酰胺Ⅱ來源于N－H彎曲和C－N伸縮振動。當Mb固定于CDA-\\BF4膜內時，可觀察到與天然Mb峰形相似的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ吸收峰（圖2b）。但酰胺Ⅱ吸收峰位移到1603 cm－1處，可能是由于修飾膜CDA-\\BF4的吸收峰（圖2c）與Mb的吸收峰有一定重疊引起的。這也表明Mb在CDA-\\BF4膜內基本保持了其天然構象。 圖1 Mb在不同溶液中的紫外-可見吸收光譜

Fig．1 UV-Vis spectra of （a） myoglobin（Mb）， （b） cellulose diacetate （CDA）-1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoro-borate（\\BF4）-Mb， （c） CDA and （d） \\BF4 in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS

圖2 天然Mb（a），CDA-\\BF4-Mb （b）和CDA-\\BF4 （c）的傅里葉變換紅外光譜圖

Fig．2 FT-IR spectra of natural Mb（a），CDA-\\BF4-Mb （b） and CDA-\\BF4 （c）

3.2 CDA-\\BF4-Mb/GCE的表征

通過掃描電鏡研究了CDA和CDA-\\BF4-Mb在玻碳電極表面的表觀形貌。由圖3可見， 二者表觀形貌差異很大。CDA呈現一致、有序、疏松的狀態， 當加入\\BF4離子液體及Mb后， 電極表面形成一層致密、平滑的膜，并呈現蛋白質顆粒嵌入的形態， 表明Mb已成功地結合到CDA-\\BF4膜中。

K3Fe（CN）6作為考察電極性能的常用探針， 被用于研究不同修飾電極的電化學性能。由圖4可知， 在0.5 mmol/L K3Fe（CN）6-0.1 mol/L KCl溶液中， 裸玻碳電極（曲線a）上出現了一對峰形較好的氧化還原峰; 電極僅修飾CDA時（曲線b）， 氧化峰及還原峰電流均明顯降低， 表明CDA膜阻礙了K3Fe（CN）6的電子轉移; 當將CDA及\\BF4的混合溶液修飾到電極上時（曲線c）， 相對于僅修飾CDA的電極（曲線b），電流又明顯升高。這可能因為離子液體具有良好的導電率， 并且咪唑類離子液體

圖3 （a） CDA和 （b） CDA-\\BF4-Mb在玻碳電極表面的掃描電子顯微鏡圖

Fig．3 SEM images of （a） CDA and （b） CDA-\\BF4-Mb on a GCE surface

圖4 不同電極在K3Fe（CN）6溶液中的循環伏安圖

Fig．4 Cyclic voltammograms of （a） GCE， （b） CDA/GCE， （c） CDA-\\BF4/GCE and （d） CDA-\\BF4-Mb/GCE

Solution: 0.5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（1∶1， V/V） containing 0.1 mol/L KCl. Scan rate: 0.15 V/s．的結構與溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）、溴化十二烷基三甲基銨等可溶性單鏈陽離子表面活性劑相似，基于這些物質形成的單分子層構建了一個電子通道，從而促進了K3Fe（CN）6和基底電極之間的電荷轉移; 而在CDA-\\BF4-Mb修飾玻碳電極上（曲線d）， K3Fe（CN）6氧化還原峰電流再次降低， 表明Mb成功修飾到電極表面， 從而阻止了\\3－向電極表面的擴散。



圖5為不同修飾電極在0.5 mmol/L K3Fe（CN）6-0.1 mol/L KCl溶液中所獲得的交流阻抗曲線。與裸GCE（曲線a）相比， 其表面滴涂CDA （曲線b） 后阻抗增加， 表明CDA在電極表面所成的膜阻礙了電子轉移;加入導電性良好的 \\BF4（曲線c）使CDA/GCE表面阻抗降低。當Mb固定在CDA-\\BF4/GCE表面上（曲線d）， 阻抗又明顯增大，說明Mb成功地固定在CDA-\\BF4膜中。

3.3 CDA-\\BF4-Mb/GCE的電催化作用

圖6為CDA-\\BF4-Mb/GCE對連續加入的 5.0

mol/L H2O2的安培響應， 修飾電極對H2O2呈現較快的響應。插圖的工作曲線表明， H2O2濃度在5.0～100

mol/L范圍時， 修飾電極催化響應電流與H2O2濃度呈良好的線性關系，I（

A）＝ 0.03857CH2O2（

mol/L）＋0.4181 （r＝0.9988）; 檢出限為2.0

mol/L（S/N＝3）。

表觀米氏常數Km是酶促反應的特征動力學參數， 是表征酶與底物之間親合力大小的標準。 電化學方法測定Km的Lineweaver-Burk方程如下式:

1/Iss＝1/Imax＋Km/ImaxC

式中， Iss為一定底物（H2O2）濃度下修飾電極的穩態響應電流; Imax為底物飽和條件下測得的穩態電流最大值; C為底物濃度。在一定范圍內， 用圖6插圖工作曲線中的數據作1/Iss-1/Ｃ圖， 擬合得到線性方程1/Iss＝0.08967＋15.76/C（H2O2）（r＝0.9986）， 由其斜率和截距求得Km＝1.758 ×10－4 mol/L。 Km越小， 表明酶與底物的親合力越大， 酶的活性受抑制的程度越小。與Mb-HMS/GCE （Km＝5.2 mmol/L）\\ 相比， 較小的Km說明CDA-\\BF4-Mb/GCE對H2O2有較高的催化能力。

圖5 不同修飾電極的交流阻抗曲線

Fig．5 Electrochemical impedence spectra recorded at （a） bare， （b） CDA， （c） CDA-\\BF4 and （d） CDA-\\BF4-Mb modified GCE

Solution: 0.5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6 （1∶1， V/V） containing 0.1 mol／L KCl. Applied potential: 0.2 V （vs. SCE）. Frequency range: 0.01－104 Hz.

圖6 CDA-\\BF4-Mb/GCE在－0.5 V處對H2O2的安培響應

Fig．6 Amperometric responses of CDA-\\BF4-Mb/GCE at －0.5 V upon successive additions of 10

L 5 mmol/L H2O2 to 10 mL pH 7.0 buffer

Inset: The linear relationship of current and concentration of H2O2

3.4 CDA-\\BF4-Mb/GCE的重現性和穩定性

采用CDA-\\BF4-Mb/GCE修飾電極對10

mol/L H2O2平行測8次，所得相對標準偏差為6.3%。采用6支同一批次制備的電極對10

mol/L H2O2平行測6次，所得相對標準偏差為5.7%。穩定性是衡量電極實用性的重要指標。考察了CDA-\\BF4-Mb/GCE氧化還原峰電流與其保存時間的關系。結果表明， 隨著保存時間的增加， 峰電流緩慢減弱， 保存7 d后， 峰電流僅減少了5%。說明Mb在二醋酸纖維素-離子液體修飾玻碳電極上的直接電子轉移比較穩定， 這可能是二醋酸纖維素與玻碳電極間較好的親合力作用的結果。

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Hydrogen Peroxide Biosensor Based on Cellulose Diacetate-

Ionic Liquid Film Immobilizing Myoglobin

DONG She-Ying*1， GU Guang-Zhe1， YU Zhu-Qing1， ZHOU Yuan-Zhen1， TANG Hong-Sheng2， ZHENG Jian-Bin2

1（College of Sciences， Xi′an University of Architecture and Technology， Xi′an 710055）

2（Institute of Analytical Science， Shaanxi Provincial Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry，

Northwest University， Xi′an 710069）

Abstract The myoglobin （Mb） was immobilized on the surface of glassy carbon electrode （GCE） by using composite of cellulose diacetate （CDA） and ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate （\\BF4）. Spectroscopic analysis of the CDA-\\BF4-Mb film showed that the Mb could retain its natural structure and bioactivity. The conductivity of the modified electrode had been greatly improved due to the doping of ionic liquid， which facilitated the electronic transfer of the CDA-\\BF4-Mb membrane. Further experiment demonstrated that the Mb modified electrode exhibited an electrocatalytic activity for the reduction of H2O2. The catalytic peak current was linear to H2O2 concentration in the range of 5.0－100

mol/L with a detection limit of 2.0

mol/L. The apparent Michaelis-Menten constant （Km） was estimated to be 1.758×10－4 mol/L.

Keywords Myoglobin; Cellulose diacetate; Ionic liquid; Hydrogen peroxide; Electrocatalysis

（Received 30 January 2011; accepted 22 April 2011）