多壁碳納米管修飾鉑基片石英晶體微天平研究白細胞介素-6與其受體的相互作用

摘 要 在pH 7.4、室溫條件下，用多壁碳納米管（MWCNTs）修飾石英晶體微天平（QCM） Pt 基片，經過EDC/NHS活化后固定白細胞介素-6（IL-6），檢測不同濃度可溶性白細胞介素-6受體（sIL-6R）與IL-6的結合所引起響應信號的變化，并用Origin軟件對數據進行擬合分析，構建了一種高性能實時監測IL-6與sIL-6R之間相互作用的親和型生物傳感器。實驗表明: 隨著sIL-6R濃度的增加，其結合量呈線性增長，相關系數（R2）為0.997。IL-6與sIL-6R之間相互作用的結合平衡常數（KA）和解離平衡常數（KD）分別為3.37×106 L/mol和2.97×10－7 mol/L。驗證了通過MWCNTs修飾的Pt QCM能夠高效監測IL-6與sIL-6R間相互作用及動力學過程，有助于闡明二者的生物學功能。

關鍵詞 多壁碳納米管； Pt基片； 石英晶體微天平； 白細胞介素-6； 可溶性白細胞介素-6受體

2010-12-08收稿；2011-04-12接受

本文系國家自然科學基金（Nos. 30870665， 30772746， 90709038）和天津市自然科學基金（Nos. 08JCZDJC20600， 09ZCGHHZ00100）資助項目

* E-mail: qiangchen@nankai.edu.cn

1 引 言

白細胞介素-6（Interleukin-6， IL-6）是一種多功能細胞因子，在免疫應答、造血系統調控和腫瘤細胞生長等方面發揮重要的生物學效應［1］。IL-6的生物學功能是通過與白細胞介素-6受體（Interleukin-6 receptor， IL-6R）相結合，從而觸發胞內信號轉導來實現的。IL-6R有兩種，一種分布在細胞膜表面，另一種分布在體液中的可溶性IL-6R（Soluble interleukin-6 receptor， sIL-6R）中。研究表明，sIL-6R可作為IL-6介導生理應答反應的高效增強劑發揮作用［2，3］。

IL-6和sIL-6R之間的相互作用監測通常采用放射免疫技術或酶聯免疫法等，但是利用這些檢測方法很難對其進行動力學分析，并且操作繁瑣、耗時［4］。壓電石英晶體微天平（QCM）具有輕便、簡單、成本低等特點，并能夠實時監測生物大分子間相互作用的動力學過程，因此被廣泛應用于生物分析、臨床診斷以及環境監測中［5，6］。碳納米管（Carbon nanotubes， CNTs）是日本科學家Iijima于1991年發現的一種新型碳材料［7，8］。由于CNTs具有優異的導電性能、較強的吸附能力和良好的生物相容性等［9，10］，被廣泛應用于藥物投遞、細胞運輸、骨骼誘導等體系中［11～13］。由于生物體系中存在大量Cl－，而Pt基片在此體系中可以保持高穩定性，因此使Pt QCM表現出很多獨特性質［14，15］和高抗干擾能力［16］。由于Pt 基片很難通過常規的酰胺化方法與生物大分子相連，因此Pt QCM很少應用于監測蛋白、抗體或生物組織等大分子中［17］。本實驗將羧基化的MWCNTs修飾在Pt 基片表面，經過EDC/NHS活化后固定IL-6，制備了一種監測IL-6和sIL-6R相互作用動力學過程的高性能的新型生物傳感器。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SEIKO QCA917型石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance， QCM，EG＆G公司）；AT-切割石英晶體鉑金基片（表面積為（0.19±0.01）cm2），工作頻率為9 MHz；KQ-218型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；QUANTA200型掃描電子顯微鏡（SEM，FEI公司）。

1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙酸）碳二亞胺（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodimide， EDC）、N-羥琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide， NHS）、牛血清白蛋白（BSA，MW 66000）， 均購自Sigma公司; 重組人IL-6及sIL-6R（Peprotech公司）; MWCNTs （O. D. ＝8～12 nm，Length＝0.5～1.0

m，中國科學院成都有機化學有限公司，純度＞95%）。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）。其它試劑均為分析純。實驗用水為Milli-Q去離子二次蒸餾水; 實驗溫度為25 ℃。

2.2 碳納米管的預處理

利用濃H2SO4-濃HNO3（3∶1，V/V）的混和酸將MWCNTs溶解，超聲振蕩4 h。以去離子水為清洗劑，將酸處理的MWCNTs多次離心、洗滌，調節pH值至中性，即得到羧基化的MWCNTs（圖1a）。將干燥后的MWCNTs超聲分散于去離子水中，配成1 g/L 溶液。

2.3 Pt基片表面活化與IL-6在基片表面的固定

將Pt基片用去離子水清洗，再用純甲醇浸泡30 min，然后以去離子水沖洗3次，超聲波清洗3 min，用N2吹干。在處理好的Pt基片表面滴加20

L MWCNTs溶液，用PBS沖洗3次，以除去未吸附的MWCNTs，形成一層致密的MWCNTs薄膜（圖1b）。加入EDC/NHS混合液（0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS）反應約30 min，用于活化MWCNTs的羧基（圖1c）。活化的羧基可與IL-6的氨基以酰胺鍵共價結合，從而將IL-6固定于Pt基片表面（圖1d）。

分 析 化 學第39卷

第9期房鈺鑫等: 多壁碳納米管修飾鉑基片石英晶體微天平研究白細胞介素-6與其受體的相互作用

圖1 MWCNTs的預處理及IL-6在基片上的固定

Fig．1 Schematic diagram for pretreatment of MWCNTs and immobilization of interleukin （IL-6） on Pt electrode of quartz crystal microbalance （QCM）

（a） MWCNTs的羧基化（Carboxylation of MWCNTs by H2SO4 and HNO3）; （b） MWCNTs在基片表面的固定（Modification of MWCNTs on Pt electrode of QCM）; （c） EDC/NHS活化 （Activated MWCNTs by 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodimide/N-hydroxysuccinimide） EDC/NHS）; （d） IL-6的固定（Immobilization of IL-6 on Pt electrode of QCM）。

2.4 IL-6和sIL-6R的結合

將IL-6包被的Pt基片用PBS沖洗3次，待基線達到平衡后，分別加入一定濃度（3.13， 6.25， 12.5和25.0 mg/L） 的sIL-6R，使之與IL-6充分反應達到平衡。用PBS反復沖洗，以除去非特異吸附的sIL-6R。

3 結果與討論

3.1 MWCNTs修飾Pt基片的掃描電鏡表征

將分散的MWCNTs懸浮液滴在Pt基片表面，形成致密的MWCNTs薄膜。由滴加MWCNTs前后Pt基片的掃描電鏡圖（圖2）可見，MWCNTs比較均勻地吸附在Pt基片表面。

圖2 （A） 空白Pt基片掃描電子顯微鏡圖，（B） 修飾有MWCNTs的Pt基片掃描電子顯微鏡圖

Fig．2 （A） SEM image of bare Pt electrode， （B） SEM image of Pt electrode modified with MWCNTs

3.2 sIL-6R的固定

由于QCM是一種能夠連續、實時監測蛋白間相互作用的儀器，因此可以進行蛋白間動力學監測分析。QCM響應頻率的變化值與沉積在基片表面物質的質量之間關系符合Sauerbrey 方程［18］:

ΔF＝－2.26×10－6 F02Δm/A （1）

式中，Δm為基片表面結合物質的質量（g），ΔF為結合物質所引起的頻率變化（Hz），A為基片的有效面積（cm2），F0為基片固有的振動頻率（Hz）。不同濃度（3.13， 6.25， 12.5和25.0 mg/L）的sIL-6R與IL-6之間特異性結合所引起的頻率變化見圖3。隨著sIL-6R濃度的增加，基片的振動頻率逐漸降低。當加入高濃度樣品時，振動頻率有一個明顯的瞬間直降，這可能是由于加樣對基片的機械擾動引起的。

為了驗證IL-6與其受體sIL-6R在基片表面的特異性結合，以及排除非特異性蛋白的干擾，引入了BSA作為對照。如圖4所示，在IL-6修飾基片后，分別加入相同濃度（25.0 mg/L）的BSA和sIL-6R。加入BSA后，基片振動頻率下降，但是用PBS沖洗后，振動頻率又恢復到初始基線狀態；而sIL-6R的加入引起了顯著的頻率變化。由此可見，IL-6與sIL-6R的結合具有特異性，其它蛋白（例如BSA）與IL-6的非特異性相互作用是可以忽略不計的。

圖3 不同濃度的sIL-6R與IL-6之間特異性結合所引起的頻率變化曲線

Fig．3 Individual binding curves of soluble interleukih-6 receptor （sIL-6R） in various concentrations on IL-6-1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodimide/n-hydroxysuc-cinimide （EDC/NHS）-MWCNTs activated Pt QCM

sIL-6R concentration: （a） 3.13 mg/L; （b） 6.25 mg/L; （c） 12.50 mg/L; （d） 25.00 mg/L.

圖4 （a） 25.0 mg/L非特異性蛋白（BSA）在修飾后基片表面的吸附； （b） 25.0 mg/L sIL-6R在修飾后基片表面的特異性吸附

Fig．4 （a） Nonspecific adsorption of 25.0 mg/L BSA on the modified electrode， （b） specific adsorption of 25.0 mg/L sIL-6R on modified electrode

根據公式（1）可計算出不同濃度下的sIL-6R結合在基片上的質量。圖5表示結合在基片上sIL-6R的質量與sIL-6R溶液濃度之間的關系。隨著sIL-6R濃度（c，mg/L）的增加，結合在基片上的sIL-6R的質量（Δm，ng）呈線性增長，其線性關系符合Δm＝4.23c＋11.9 （R2＝0.997）。

3.3 IL-6與sIL-6R相互作用的動力學分析

sIL-6R在基片上的吸附過程（ΔF-t曲線）符合Langmuir 吸附方程［19］，即

f＝kdcFmaxka＋kd{1－exp（kac＋kd）t}＝Feqexp（－kobst）（2）

式中， ka為結合速率常數，kd為解離速率常數，kobs為表觀結合速率常數，c為待測物質濃度，Fmax為基片表面吸附的靶分子達到飽和時所引起的頻率變化。用Origin 軟件對不同濃度的ΔF-t曲線進行非線性擬合，得到相應的kobs。圖6是對不同濃度的sIL-6R與IL-6結合的表觀結合速率常數進行分析的工作曲線。其擬合的線性回歸方程為

kobs＝0.392c＋9.29 （R2＝0.988）。所擬合曲線的斜率與截距比為結合平衡常數（KA），因此，sIL-6R與IL-6的KA為3.37×106 L/mol，而解離平衡常數KD＝1/KA，得出KD為2.97×10－7 mol/L。據文獻［17，20］報道，由于反應條件和實驗環境的不同，sIL-6R與IL-6之間的解離平衡常數在10－6～10－9 mol/L范圍內，本研究所得數據符合此范圍，故本方法是可靠的。

圖5 sIL-6R的吸附量與sIL-6R濃度之間的關系

Fig．5 Combined masses of sIL-6R in various concentrations on IL-6-EDC/NHS-MWCNTs activated Pt QCM. The combined masses of sIL-6R increased linearly with increasing concentration of sIL-6R

圖6 表觀結合速率常數 kobs 與sIL-6R濃度之間的線性關系

Fig．6 Linear correlation between the apparent binding rate constant kobs and concentrations of sIL-6R

4 結 論 

本研究利用MWCNTs修飾QCM Pt 基片，構建了一種實時監測IL-6與sIL-6R之間相互作用的親和型生物傳感器。實驗表明，通過MWCNTs修飾的Pt QCM能夠高效監測IL-6與sIL-6R間相互作用及動力學過程，IL-6與sIL-6R之間相互作用的結合平衡常數（KA）和解離平衡常數（KD）分別為3.37×106 L/mol和2.97×10－7 mol/L。本傳感器操作簡便、有效。此外，由于體內IL-6及其受體是活血化瘀中藥潛在的作用靶點，因此，研究二者之間結合動力學過程可為探究中藥作用機理提供一種新的研究方法。

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Interaction of Interleukin-6 and Soluble Interleukin-6 Receptor

Based on Multi-walled Carbon Nanotubes Activated

Pt Quartz Crystal Microbalance

FANG Yu-Xin1， SHANG Hong-Cai2， QIN Xia1， FAN Guan-Wei2， ZHANG Di1， ZHAO Wei1，

LI Zheng-Chun1， ZHANG Bo-Li2， CHEN Qiang*2

1（The Key Laboratory of Bioactive Materials， Ministry of Education，

College of Life Science， Nankai University， Tianjin 300071）

2（Institute of Traditional Chinese Medicine Research， Tianjin University of Traditional

Chinese Medicine， Tianjin 300193）

Abstract An affinity biosensor using multi-walled carbon nanotubes to activate Pt quartz crystal microbalance （QCM） electrode and immobilizing interleukin-6 （IL-6） on 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodimide （EDC）/N-hydroxysuccinimide （NHS）-activated QCM electrode was employed to real time detect the interaction and kinetic analysis of IL-6 and soluble interleukin-6 receptor （sIL-6R）， and the association data between IL-6 and sIL-6R was fitted by Origin software. The results showed that the combined masses of sIL-6R on IL-6-EDC/NHS-MWCNTs activated Pt QCM increased linearly with the increase of concentration of sIL-6R， and the linear correlation coefficient was 0.997. For the interaction， KA was 3.37×106 L/mol， and KD was 2.97×10－7 mol/L. The experiment proves the feasibility of using multi-walled carbon nanotubes activated Pt quartz crystal microbalance to monitor the interaction and kinetic analysis of IL-6 and sIL-6R， it can help to clarify the important biological function of IL-6 and sIL-6R. All experiments were performed in PBS （0.01 mol/L， pH 7.4） at room temperature.

Keywords Multi-walled carbon nanotubes; Platinum electrode; Quartz crystal microbalance; Interleukin-6; Soluble interleukin-6 receptor

（Received 8 December 2010; accepted 12 April 2011）