基于自動磁珠轉運的轉基因蛋白Cry1Ab檢測

摘 要 基于自動磁珠轉運，建立了轉基因蛋白Cry1Ab免疫檢測的新方法。利用水熱法制備了粒徑約400 nm的納米磁球，并進行電鏡表征，通過溶膠法對磁球表面進行氨基修飾，采用戊二醛偶聯對磁珠實現抗體包被，在核酸提取儀中進行酶聯免疫反應，采用分光光度法進行檢測。本方法對轉基因蛋白Cry1Ab的檢出限低于1

g/L，與商品化酶聯免疫試劑盒相當。本方法節約人力、嚴格控制時間，同時，所需設備成本較低，有望取代傳統的手動檢測技術。

關鍵詞 轉基因作物； 磁分離； Cry1Ab蛋白； 磁珠轉運； 免疫檢測

1 引 言

轉基因作物（GMOs）因其先進的生物技術優勢而發展迅速。在1996～2008年期間，種植面積增幅高達74倍，每年的增長率超過9%。雖然轉基因作物有其獨特的生物技術優勢，但其對人和動物及環境的風險尚未得到充分評估。如潛在的物種間基因流動、破壞生物多樣性、增強害蟲的抗藥性和對人類健康的威脅等因素，尚無法排除。因此，一些國家對轉基因作物進行了立法，要求對含有轉基因成分超過1%的產品進行強制標識，該含量后被降至0.9%。快速檢測GMOs成分是這些法規能否有效實施的關鍵?！禔nalytical and Bioanalytical Chemistry》期刊于2010年3月就GMOs檢測分析技術出版了專刊。

目前，檢測轉基因生物及其制品的技術可分為兩大類: 基于核酸的檢測和基于蛋白質的檢測。核酸檢測是檢測其插入的外源基因，以聚合酶鏈式反應（PCR）為主。PCR法靈敏度高，但操作復雜，對測試人員有較高的技能要求； 另外， 它耗時長、成本高和難以實現高通量檢測等也限制著其應用。蛋白層面的檢測以免疫分析最為成功，包括酶聯免疫吸附試劑盒（ELISA kit）和金膠試紙等。ELISA對操作的要求相對PCR要簡單，但對操作人員的技能要求也很重要。試紙條操作簡單，成本低廉，能較好地實現現場檢測，但難以用于定量分析。另外，免疫生物傳感器等新興技術也被用于蛋白檢測。

生物磁珠因其優良的抗原捕捉能力而備受關注。利用磁珠轉運可以方便地實現各種生化反應步驟，而不需要復雜的流體控制系統。目前，磁珠轉運應用于核酸提取和純化的研究及裝置較多，而除了醫院所使用的大型免疫磁分離發光檢測系統需要復雜流路控制外，用于免疫分析的報道較少。利用磁珠自動轉運可以使操作流程更為標準化、統一化，同時降低操作勞動強度，對操作時間和條件的控制也十分精準。本研究利用自制的免疫磁珠，結合現有的核酸提取儀，通過免疫磁珠轉運實現了對轉基因蛋白Cry1Ab的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SK3300HP超聲清洗器（科導公司）；BS224型電子天平（德國Sartorius公司）； 電動攪拌機和渦旋振蕩器（德國IKA公司）； M5多功能酶標儀（美國MD公司）； 核酸提取儀（杭州博日公司）； 單道和八道移液器（德國Eppendorf公司）； JEM-1200EX透射電鏡（日本JEOL公司）； 低溫磁場測試和試樣制備系統（美國Quantum Design公司）； 實驗用水通過去離子水機（美國Millipore公司）制備。 

Cry1Ab蛋白一抗（鼠單抗）和酶聯免疫試劑盒（美國Abraxis LLC公司）； 戊二醛、正硅酸乙酯（TEOS）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、牛血清白蛋白（BSA）、六水合三氯化鐵（FeCl3#8226;6H2O）， 購自美國Sigma-Aldrich公司；四甲基聯苯胺（TMB）單組分顯色底物（天津天健公司）。所用試劑均為分析純； 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）和PBST緩沖液（含0.1%吐溫20的PBS， pH 7.4）。

2.2 實驗方法

2.2.1 水熱法制備Fe3O4納米磁珠 綜合文獻\\的方法合成磁珠。簡言之，在25 mL內襯聚四氟乙烯的高壓反應釜中，加入0.719 g FeCl3 #8226; 6H2O、1.2 g 醋酸鈉、0.48 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和15 mL乙二醇，磁力攪拌20 min使之混合均勻；然后將反應釜蓋牢置于溫度為160

SymbolpB@ C的烘箱中反應24 h，待其自然冷卻后， 將釜內反應產物進行離心或磁分離，再經乙醇和去離子水交替清洗3次，置于真空干燥箱中60

SymbolpB@ C干燥8 h，得到黑色粉末。

2.2.2 磁珠的表面修飾 參見文獻\\的方法，在磁珠表面修飾SiO2層，制備Fe3O4@ SiO2磁珠。簡言之，取40 mg裸磁珠溶于20 mL乙醇，超聲分散，加入12 mL去離子水和2 mL氨水（25%～28%）。移入三頸燒瓶中，在45

SymbolpB@ C水浴中機械攪拌；另取400

L TEOS溶于20 mL乙醇。充分攪拌后加入到之前的三頸燒瓶中，攪拌6 h，清洗后即得到包裹有SiO2層的磁珠（Fe3O4@ SiO2）。

分 析 化 學第39卷

第9期李冬陽等: 基于自動磁珠轉運的轉基因蛋白Cry1Ab檢測

在磁珠Fe3O4@ SiO2磁珠表面修飾上氨基（NH2），參照文獻\\: 將所得Fe3O4@ SiO2 磁珠加入到100 mL 98%（V/V）乙醇中， 在三頸圓底燒瓶中機械攪拌20 min，加入100

L APTES，反應6 h；將反應產物離心或磁分離，再經乙醇和去離子水交替清洗3次；用2 mL乙醇溶解，即得20 g/L的氨基化磁珠。磁滯回線通過低溫磁場測試和試樣制備系統測得。

2.2.3 免疫生物磁珠的制備 取上述修飾有氨基的磁珠75

L加入到EP管中，用PBS緩沖液清洗3次；加入10%戊二醛溶液，圓周混合反應1 h，再用PBS清洗3次，即得到戊二醛活化的修飾有醛基的磁珠；向其中加入20

L 1 g/L轉基因蛋白Cry1Ab一抗和280

L PBS，于室溫下圓周混合3 h; 清洗后加入300

L 0.2 mol/L甘氨酸混合15 min，封閉剩余的醛基；加入含（m/V）BSA 2.5%的PBS溶液混合15 min，封閉非特異性吸附位點；清洗過后加入350

L PBS進行渦旋振蕩，即得到均勻的修飾有一抗的免疫生物磁珠懸浮液。

2.2.4 自動磁珠轉運 取與核酸提取儀配套的96孔深孔板（每孔容積約為1.2 mL），在軟件中編寫程序，設定操作和每步的運行時間。與傳統的生化反應系統不同，核酸提取儀通過磁珠的轉運實現一系列不同的生化反應步驟，由于磁珠的轉運可以通過磁棒運動實現，因此整個系統避免了復雜的流路控制體系。核酸提取儀在工作時（圖1），套有一次性塑料套頭的磁棒和套頭可以同步運動，也可以分開運動。當需將樣品從一個操作步驟（一列孔）轉移到下一操作步驟時（另一列孔），磁棒會進入套頭底部并和套頭一起運動到孔底，磁吸附60 s后，磁棒連帶套頭及吸附在上面的磁珠進入到下一步驟（一列孔）。此時，磁棒離開套頭并上移至頂部，吸附在套頭上的磁珠被釋放到溶液中，并在套頭連續的上下運動帶動下分散開來。本實驗中的抗原分析物Cry1Ab蛋白、二抗（兔多抗）和酶標抗體（標記有HRP酶的羊抗兔IgG）均來自Abraxis公司的試劑盒，抗原濃度為0， 0.25， 1， 2和4

g/L，抗體皆為試劑盒工作濃度。第一列中取5孔加入不同濃度的抗原，其余各列中同列孔的加樣量相同。各列孔的加樣量和操作時間見表1， 檢測原理如圖1。

10 PBST: Phosphate buffered saline Tween-20; TMB: 3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine

2.2.5 比色分析 在磁珠轉運操作的最后一步（第8列）結束后，磁頭會將夾心結構的磁珠免疫復合物吸走，隨即與TMB的顯色反應停止（5 min內高濃度孔吸光值A650變化小于0.004，在儀器分辨率±0.006范圍內）。比色測試在M5多功能酶標儀上完成。

圖1 磁珠轉運原理示意圖（以第1和2列的第1孔之間轉運為例）

Fig．1 Illustration of magnetic beads-based transfer （take the transfer between well 1 of column 1 and 2 as example）

3 結果與討論

3.1 Fe3O4納米磁珠的制備及表征

水熱法優點在于合成較為簡單， 粒徑分布非常窄，均勻度好，形貌容易控制。乙二醇是一種具有高沸點的強還原劑，被廣泛用于羥基化以形成單分散性好的金屬或金屬氧化物納米顆粒。醋酸鈉作為一種靜電作用穩定劑，可以起到防止納米顆粒聚集的效用。另外，PVP作為表面活性劑可以進一步防止顆粒聚集。圖2a為采用水熱法合成的磁珠TEM照片，顆粒近似于球狀，直徑約 440 nm。

TEOS在氨水的堿性環境下能水解產生SiO2，這樣便可以在裸磁珠的表面形成SiO2層。一方面可以起到保護作用，防止Fe3O4納米顆粒被進一步氧化，同時防止Fe3O4裸磁珠參與別的反應，例如催化TMB; 另一方面，新形成的SiO2層表面有豐富的羥基，可以為進一步修飾提供充足的偶聯位點。本研究修飾上的SiO2層厚度約為45～60 nm（圖2b）。APTES作為一種高效的硅烷偶聯劑，被廣泛用于在表面修飾上氨基。APTES不同于TEOS，它在空氣中即可吸潮發生反應，因為它有富含電子的氨基活性中心，能迅速與氫供體（如羥基等）作用發生吸附和催化縮合，即使在無水環境下也可以發生反應。Rossi等曾在無水環境下，以無水乙醇為溶劑，加入0.75% APTES，即在共沉積法所獲磁珠的表面修飾上足夠的氨基， 并成功用于葡萄糖氧化酶的偶聯。在有機相中， APTES水解較慢，傾向于形成可控性較強的單層，

而在水相中， APTES水解劇烈，易形成表面積更大、氨基位點更圖2 透射電鏡照片: （a）裸磁珠， （b）經TEOS修飾磁珠， （c）再經APTES修飾磁珠

Fig．2 TEM images of （a） bare magnetic beads， （b） tetraethyl orthosilicate （TEOS）-treated beads and （c） （3-aminopropyl）triethoxysilane （APTES）-treated beads多的多層硅層。為了盡可能多地在表面修飾上氨基，本研究在乙醇相中加入少許水相。圖2c為經TEOS和APTES修飾后的TEM圖，硅層總厚度為80～90 nm，APTES層修飾的厚度約為25～30 nm。 圖3 經APTES修飾后的磁珠的磁滯回線（飽和磁化率為56.8 emu/g）

Fig．3 Hysteresis loops of APTES-treated magnetic beads indicating magnetic saturation value of 56.8 emu/g

最終修飾好的磁珠仍保有良好的磁性。從磁滯回線（圖3）可知，磁珠的飽和磁化率為56.8 emu/g；它還表現出良好的超順磁性（例如，當外加磁場移除時，不存在剩磁），這是由于磁珠中存在小于30 nm的磁納米顆粒組分；磁珠的超順磁性能防止外加磁場移除后磁珠發生聚集，并且能使之迅速重新分散。由于超順磁性和硅層的屏蔽效應，硅層修飾后的磁珠能夠輕易且穩定地分散在水溶液中。本實驗中經APTES修飾后的磁珠的濃度約1.08×1010個/mL，將該磁珠置于EP管中，再外加磁場（約4000高斯）后，能在1 s內完成磁分離，這表明所制磁珠有良好的磁響應能力。磁珠作為分離工具進行應用時，磁珠的分散性和對磁場的靈敏性是兩個需考慮的重要因素。

3.2 生物免疫磁珠的功能化

自Avrameas提出將戊二醛用于偶聯抗體和酶標以來，該方法因簡單、高效，在偶聯中能極好地保持抗體分子的免疫活性和酶分子的催化活性而被廣泛應用，并為Sigma-Aldrich公司在商業化酶標抗體生產和Bangs 公司生物磁珠的偶聯中所使用。Avrameas還發現，在極端條件下，用戊二醛活化的HRP酶的活性很穩定，而未經戊二醛處理的HRP酶容易失活。本研究采用戊二醛活化磁珠表面的氨基，并采用了較高的濃度（10%），以保證磁珠表面的氨基得到充分活化。但是，戊二醛法容易發生自聚，在修飾上抗體等蛋白時，當蛋白濃度太低，易出現幾個磁珠連一個蛋白的現象，造成肉眼可見的凝集，影響分散的均勻性，并導致沉降。本研究中13

g蛋白/mg磁珠偶聯時所得生物磁珠較為均勻，故本研究采用20

g轉基因一抗修飾75

L磁珠。

3.3 免疫檢測與比色

磁珠轉運與分離技術已廣泛用于核酸等的純化與分離，而用于免疫檢測則鮮見報道。本研究利用核酸提取儀，成功實現了基于免疫磁珠轉運的轉基因蛋白免疫檢測。 圖4 加HCl前后不同濃度的抗原Cry1Ab蛋白的吸光值信號響應

Fig．4 Absorbance response of varying Cry1Ab protein concentration with and without addition of HCl最終得到的免疫復合物中的HRP酶可以催化底物TMB的反應，得到藍色產物，該藍色產物的最大吸收波長為650 nm；在藍色產物中加入HCl或H2SO4時，會得到黃色終產物，此時溶液的最大吸收波長轉移至450 nm。第8列孔中用TMB顯色10 min后，加1 mol/L HCl終止前后的結果見圖4。加HCl后，方法的檢測靈敏度提高了約2倍，線性從R2＝0.9707增加到R2＝0.9986。方法能夠檢測出低至1

g/L Cry1Ab蛋白。按文獻\\， 該結果折合約為真實GMOs樣品中0.5%，達到歐盟的檢測標準（低于0.9%）。本方法的重現性良好（RSD＜5%）。所需的樣本量為100～300

L。較之同類型的美國Abraxis LLC公司酶聯免疫試劑盒，本方法在檢出限、靈敏度及樣本量等各種指標都相當。本方法較簡便地實現了基于磁珠轉運的酶聯免疫自動檢測，為實現大批量、長時間和高工作強度的檢測提供了可能性。

本實驗研究了免疫磁珠的制備方法，驗證了將核酸提取儀用于免疫磁分離檢測的可行性，實現了基于磁珠轉運的轉基因蛋白的酶聯免疫檢測。

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LI Dong-Yang， FAN Kai， WU Jian*， YING Yi-Bin

（College of Biosystem Engineering and Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310029）



Abstract A novel method for the immunoassay of genetically modified organisms （GMOs） protein Cry1Ab was proposed. First the nano-magnetic beads with the diameters around 400 nm were prepared by hydrothermal method. Then， the prepared magnetic beads were modified with NH2 group using sol-gel approach. The antibodies were conjugated on the surface of magnetic beads through bi-functional agent glutaraldehyde. The immunoassay was carried out in the nucleic acid extractor which is commercial available. In this proposed method， the detection limit for Cry1Ab is less than 1

g/L， which is comparable to the common ELISA methods. This automatic way is promising for its rapidity and simplicity.

Keywords Genetically modified organisms; Magnetic separation; Cry1Ab protein; Magnetic beads transfer; Immunoassay

（Received 16 November 2010; accepted 21 April 2011）