健脾益氣方含藥血清對人胃癌細胞株MKN-28凋亡的影響

邢曉靜 ，谷小虎，趙 巖，椰慧楠，鄭洪新

(1遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110042;2遼寧中醫(yī)藥大學)

中醫(yī)理論認為，健脾益氣為胃癌的基本治則［1］。2010年6～12月，我們采用血清藥理學方法，觀察健脾益氣方含藥血清對人胃癌細胞株MKN-28凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人胃癌細胞株MKN-28(購自上海細胞庫)。高糖DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Hoechst染色試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物公司)，MTT(Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MKN-28培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長。每2～3 d傳代1次，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 健脾益氣方含藥血清制備 用水煎法提取健脾益氣方藥物成分(參照張奮:碩士學論文2008，化痰散結(jié)中藥甲腫消對甲狀腺細胞凋亡影響的實驗研究中的方法)，過濾、濃縮、得生藥浸膏劑。取空腹(禁食12 h)的雄性Wistar大鼠16只，隨機分為兩組:中藥組10只，按成人(65 kg體質(zhì)量)藥物劑量的10倍量灌胃，2 ml/次、2次/d、連續(xù)7 d;無藥組6只，生理鹽水灌胃，2 ml/次、2次/d、連續(xù)7 d。兩組無在末次灌胃1 h后，股動脈采血，放置2 h促凝，1 500 r/min離心10 min，收集上清(分別為含藥和無藥血清)，過濾，－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞分組及細胞增殖抑制率測算 取MKN-28(5 000/孔)，分別加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%含藥血清培養(yǎng)(含藥組)，添加胎牛血清使培養(yǎng)體系總血清比例為10%;以加入無藥血清的細胞為對照(對照組)，所加大鼠血清濃度梯度與含藥組等同;以加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為空白組，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時，采用MTT法檢測波長為490 nm處的OD值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(空白組OD值－實驗組OD值)/空白組OD值×100%。含藥組、對照組均為實驗組。

1.2.4 細胞形態(tài)觀察 將MKN-28接種于含蓋玻片細胞培養(yǎng)板中，分別加入 5.0%、7.5%、10.0% 的含藥血清，48 h后行Hoechst33258染色，共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)、熒光強度、細胞核形態(tài)。對照組同理。

1.2.5 細胞周期測定 取MKN-28 1×105個接種至細胞培養(yǎng)瓶中，分別加入 5.0%、7.5%、10.0% 的含藥血清，48 h后，采用流式細胞術測定細胞周期。對照組同理。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，抑制率及細胞周期比較采用t檢驗，相關性分析采用一元回歸分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度含藥血清對MKN-28增殖抑制率的比較 見表1。含藥組MKN-28增殖抑制率與作用時間(R2分別為 0.912、0.897、0.995)和血清濃度梯度(R2分別為 0.996、0.973、0.972、0.978)呈正相關(P 均 ＜0.05)。

表1 加入不同濃度血清培養(yǎng)24、48、72 h時兩組MKN-28增殖抑制率比較(%，±s)

表1 加入不同濃度血清培養(yǎng)24、48、72 h時兩組MKN-28增殖抑制率比較(%，±s)

注:與對照組相同時點、血清濃度比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與同組相同時點、高一血清濃度比較，#P＜0.05，▲P＜0.01;與同組相同濃度、前一時點比較，●P ＜0.05，□P ＜0.01

組別 MKN-28增殖抑制率24 h 48 h 72 h對照組2.5% 0.00 ±5.18 3.87 ±7.10 15.77 ±4.65 5.0% 0.83 ±3.79 3.85 ±9.40 20.84 ±1.62 7.5% 3.31 ±2.96 7.55 ±9.00 19.44 ±6.51 10.0% 8.73 ±9.56 12.89 ±6.43 25.03 ±4.49含藥組2.5% 3.12 ±2.99 14.73 ±8.29●□ 28.99 ±3.42△▲□5.0% 3.69 ±4.42# 17.67 ±4.87*#●□ 42.98 ±3.45△▲□7.5% 15.25 ±3.69△ 29.52 ±3.47△▲●□ 55.59 ±2.70△▲□10.0% 24.09 ±7.95▲ 50.37 ±4.10△▲●□ 65.84 ±3.46△▲□

2.2 細胞形態(tài)學觀察 含藥組細胞染色呈強藍色熒光，經(jīng)5%含藥血清處理后，細胞核出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，表現(xiàn)為著色較深;經(jīng)7.5%含藥血清處理后，細胞核濃縮加劇，呈現(xiàn)致密濃染;10.0%含藥血清處理后，細胞核呈碎塊狀致密濃染。對照組細胞染色呈微弱熒光，細胞核完整。

2.3 細胞周期檢測 含藥組四倍體期細胞所占比例下降。詳見表2。

表2 加入不同濃度血清培養(yǎng)48 h兩組MKN-28細胞周期比較(±s)

表2 加入不同濃度血清培養(yǎng)48 h兩組MKN-28細胞周期比較(±s)

注:與對照組相同血清濃度比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與同組高一血清濃度比較，#P＜0.05

組別 二倍體期(%) 四倍體期(%)對照組5.0% 61.71 ±2.91 38.29 ±2.91 7.5% 61.71 ±1.70 38.29 ±1.70 10.0% 64.06 ±1.63 35.94 ±1.63含藥組5.0% 65.02 ±1.20*# 34.98 ±1.20*#7.5% 68.34 ±1.15＊＊ 31.66 ±1.15＊＊10.0% 69.87 ±1.99＊＊ 30.13 ±1.99＊＊

3 討論

胃癌發(fā)病原因尚不清楚，多數(shù)病例確診時已屬中晚期，療效欠佳［2］。研究證實，某些中藥有效成分如大蒜素、苦參堿、白藜蘆醇等對胃癌細胞具有增殖抑制作用，并可誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡［3］。

健脾益氣方由茯苓、木香、蜈蚣、陳皮、當歸等組成。已有研究證實，茯苓對提高腫瘤患者的T淋巴細胞活性，特別是CD4+/CD8+具有較明顯的效果［4］;木香中的木香倍半萜則對人肺癌細胞株A549、胃癌細胞株SGC-7901和白血病細胞株K562、HL-60等有增殖抑制作用［5］;蜈蚣中含有類組胺物質(zhì)，對胃癌細胞、肝癌細胞具有抑制作用［6］。本研究采用血清藥理學方法觀察健脾益氣方含藥血清對胃癌細胞的作用，可避免中藥粗提物直接加入反應體系中，提高實驗結(jié)果的可信度。

本研究結(jié)果顯示，健脾益氣方含藥血清對MKN-28存在增殖抑制作用，且與含藥血清濃度和作用時間呈梯度依賴性。經(jīng)含藥血清處理后，MKN-28出現(xiàn)細胞核濃縮現(xiàn)象，呈致密濃染;四倍體期細胞所占比例下降，且高濃度含藥血清比低濃度含藥血清的細胞凋亡誘導效應明顯增強，說明健脾益氣方含藥血清具有誘導MKN-28細胞凋亡的作用。

［1］王玉，章永紅.胃癌的中醫(yī)研究進展［J］.長春中醫(yī)藥大學學報，2009，25(5):791-792.

［2］張玉超，申虎，雷海龍，等.胃癌治療的研究進展［J］.中外醫(yī)療，2010，29(14):191-192.

［3］王艷艷，王威，李紅巖.中藥有效成分抗胃癌作用研究進展［J］.中國藥房，2007，18(30):2383-2385.

［4］許小娟.參苓白術散治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤術后胃腸功能紊亂58例［J］.吉林中醫(yī)藥，2006，26(1):21.

［5］王潞，趙烽，何恩其，等.18種木香倍半萜對6種人源腫瘤細胞增殖的影響［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20(5):808-812.

［6］曲愛兵，趙維城，梁良，等.蜈蚣組織提取物抗腫瘤活性的初步研究［J］.實用腫瘤學雜志，2003，17(1):29-30.