三氧化二砷對rIL-13誘導肺成纖維細胞增殖和炎性介質表達的影響

肖 莉，李鳳春，李振華

(1中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004;2中國醫科大學附屬第一醫院)

目前研究認為，三氧化二砷(As2O3)除能誘導急性早幼粒白血病細胞凋亡外［1］，亦能抑制多種細胞增殖并促進其凋亡［2］。目前肺纖維化治療較為棘手，而IL-13為調控其病理過程的主要Th2細胞因子，其抑制劑能減輕Th2主導炎癥反應所致肺組織纖維化程度［3］。2006年12月，我們觀察了As2O3對IL-13促肺成纖維細胞增殖及炎性介質分泌的影響，旨在進一步研究As2O3的抗肺纖維化機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺 成纖維NIH3T3細胞株;0.1%As2O3注射液，重組白細胞介素(rIL)-13;四甲基偶氮唑藍(MTT)，由PBS稀釋成12 mmol/L后過濾除菌，4℃避光保存;兔抗小鼠巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-1α多克隆抗體及原位雜交試劑盒，IL-6、IL-8放射免疫檢測試劑盒。

1.2 細胞處理及增殖抑制率(IR)檢測 將NIH3T3細胞接種于含體積分數10%FBS、無抗生素的DMEM培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱中飽和濕度下培養。將傳代至對數生長期且0.2%臺盼藍拒染率＞95%的細胞隨機分為觀察1組、觀察2組及對照組，調整細胞數為2×105/ml，按每孔200 μl加入96孔板中，37℃、5%CO2培養24 h后棄去培養基，觀察1組、觀察2組均加入80 ng/ml rIL-13，此外觀察1組及觀察2組分別加入2、4 μmol/L的As2O3溶液各200 μl，對照組加入DMEM，三組均培養24 h和48 h。三組每孔中加入MTT 15 μl，繼續培養3 h，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，于490 nm處測定吸光度值(每組均重復作5孔)。IR(%)=(1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

1.3 細胞處理及 MIP-1α mRNA表達測定 取NIH3T3細胞以2×105/ml種植于培養瓶和內裝有蓋玻片的6孔板中，24 h細胞貼壁后棄去培養液同上分組及處理，同時設僅加入rIL-13者為觀察3組，各組均培養24 h(每時間點設6個復孔)。采用原位雜交法測定MIP-1α mRNA表達:將培養于蓋玻片的各組細胞用4%多聚甲醛室溫固定20min，加胃蛋白酶于37℃消化60 s，37℃加預雜交液4 h，37℃雜交過夜;洗片，封閉液37℃封閉30min，分別滴加生物素化鼠抗地高辛、鏈霉親和素—生物素—酶復合物(SABC)、生物素化過氧化物酶，PBS洗滌;DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明封片。陰性對照用預雜交液替代探針工作液。采用Metamorph/DP10/型細胞圖像分析儀進行 MIP-1α mRNA半定量分析(光密度值)，其中表達陽性指細胞質內顆粒呈棕褐色點狀或條狀分布。

1.4 細胞IL-6、IL-8水平測定 收集1.3各組細胞培養上清，采用IL-6、IL-8放射免疫試劑盒檢測IL-6、IL-8水平，具體步驟按試劑盒說明進行。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示，兩樣本均數間比較用t檢驗，多個樣本均數間比較用方差分析。P≤0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 IR As2O3處理后觀察1組、觀察2組細胞增殖明顯受抑，且呈劑量和時間依賴關系(P＜0.01)，見表1。

表1 As2 O3處理后24、48 h觀察1組和觀察2組IR 比較(n=5，%，±s)

表1 As2 O3處理后24、48 h觀察1組和觀察2組IR 比較(n=5，%，±s)

注:與觀察1組同時間點比較，*P＜0.01;與同組24 h比較，△P＜0.05

24 h 48 h觀察1組 30.13±5.60 53.14±8.25組別△觀察2組 55.14±9.03* 71.05±10.62＊△

2.2 MIP-1α mRNA表達 觀察1組為15.23±3.16、觀察2組為10.22±3.56、觀察3組為40.15±3.66、對照組為25.83±2.35，觀察3組 MIP-1α mRNA表達顯著強于其他三組，且觀察2組強于觀察1組(P均＜0.05)。

2.3 IL-6、IL-8水平 見表2。

3 討論

表2 各組 IL-6、IL-8 水平(n=6，±s)

表2 各組 IL-6、IL-8 水平(n=6，±s)

注:與其他三組比較，*P＜0.01;與對照組比較，△P＜0.05

組別 IL-6(pg/ml) IL-8(ng/ml)觀察1組 109.22±20.14△0.26±0.08△觀察2組 92.64±21.66△0.25±0.11△觀察3組 548.66±71.76*0.51±0.07*對照組143.36±25.870.31±0.06

研究顯示，成纖維細胞是肺纖維化發生、發展過程中真正的效應細胞［4］，其不僅可分泌膠原促進細胞外基質沉積，還可分泌炎性介質，對中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞的活化和聚集有促進作用。我們前期的研究表明，成纖維細胞表面有IL-13受體，IL-13能促進成纖維細胞增殖、分泌炎性介質和增強Ⅰ型膠原表達［5］。As2O3是傳統中藥砒霜的主要成分，是目前腫瘤患者化療最有效的藥物之一，其作用機制主要包括刺激分化、誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖和抑制血管生成［6］。Han 等［7］發現 As2O3對子宮頸癌Hela細胞、牛肺動脈上皮細胞、人肺成纖維細胞等亦具有上述作用;我們前期實驗結果表明，As2O3可抑制NIH3T3成纖維細胞增殖，且呈時間—濃度依賴效應;As2O3可使細胞周期G0/G1期比例增加，G2/M期減少，即將細胞阻滯在G0/G1期。本研究顯示，As2O3處理后觀察1組、觀察2組細胞增殖明顯受抑，且呈劑量和時間依賴關系。進一步證實As2O3可能對肺纖維化的發展有阻滯作用，但具體機制有待于深入研究。

目前認為，肺纖維化是Th2型細胞因子調控炎癥反應的結果，細胞因子平衡向Th2方向轉化時即可導致肺纖維化，故細胞因子網絡失衡在肺纖維化發生、發展過程中起重要作用。IL-6是Th2細胞因子，正常情況下可由淋巴類或非淋巴類(如T細胞、B細胞及成纖維細胞)分泌，具有較強的促平滑肌細胞增殖作用。IL-8是中性粒細胞趨化因子，在肺部主要由肺泡巨噬細胞分泌。研究證實，肺成纖維細胞亦能分泌IL-8［8］;特發性肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細胞數量顯著增高，IL-8可能通過趨化作用募集更多的中性粒細胞而發揮致肺纖維化作用，rIL-13可促進體外培養的成纖維細胞分泌IL-6和IL-8;As2O3能降低博來霉素致肺纖維化大鼠BALF中中性粒細胞百分比及肺組織羥脯氨酸含量。本研究顯示，觀察3組IL-6、IL-8水平顯著高于其他三組。提示成纖維細胞參與了炎癥反應過程，As2O3可通過調節Th1/Th2細胞因子失衡和抑制中性粒細胞聚集發揮抗肺纖維化作用。MIP-1α屬C-C型趨化因子，可由巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞分泌，是引導單核細胞和淋巴細胞定向趨化的重要因子。多數肺纖維化在機體損傷后(損傷、炎癥和修復)一個或更多階段存在失衡［9］，其中MIP-1α等趨化因子在肺炎和肺纖維化過程中起重要作用。Standiford等研究表明，特發性肺纖維化患者BALF中MIP-1α水平顯著高于對照組，且其BALF對單核細胞的趨化活性比對照組增高1.8倍;特發性肺纖維化患者肺組織中成纖維細胞MIP-1α表達水平顯著高于對照組。本研究顯示，As2O3可抑制rIL-13促成纖維細胞內MIP-1α表達的作用，且呈劑量—效應關系。表明As2O3可能通過抑制Th2細胞因子所致趨化作用而在抑制炎癥反應和抑制成纖維細胞增殖等多方面發揮抗肺纖維化作用。

總之，As2O3可能通過抑制rIL-13誘導的成纖維細胞增殖及炎性介質表達而發揮抗肺纖維化作用。

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