GLUT4 mRNA在糖尿病大鼠骨骼肌及脂肪組織中的表達及意義

金 實，劉 聰，任劍明，紀紅梅，任 蕾

(1中國醫科大學附屬第四醫院，沈陽110032;2中國醫科大學附屬盛京醫院;3東北制藥集團;4鄭州大學第一附屬醫院)

葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)是一種跨膜轉運蛋白，作為促進葡萄糖轉運的載體，其表達及功能改變可能與骨骼肌、脂肪組織的胰島素抵抗密切相關。2010年5月，我們對GLUT4 mRNA在糖尿病大鼠骨骼肌及脂肪組織中的表達情況進行了觀察，旨在進一步探索2型糖尿病發病的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠46只，體質量180～220 g(中國醫科大學動物部);鏈脲佐菌素(STZ)，RNA 提取液，DL2000DNA Marker，GLUT4及β-actin上下游引物;胰島素放射免疫試劑盒，RT-PCR試劑盒。

1.2 動物分組及處理 將46只SD大鼠隨機分為對照組及高脂組各10只、高血糖組及糖尿病組各13只，各組均自由攝食(常規飼料)、飲水，12 h光照周期，室溫保持18～28℃，1周后禁食12 h，斷尾取血測空腹血糖。其后高脂組和糖尿病組飼喂高脂飲食(于常規飼料中分別以30%、10%、3%加入豬油、白砂糖、雞蛋黃，蛋白質、脂肪、碳水化合物所占比例分別為9.3%、59.1%、31.6%)，對照組和高血糖組則繼續飼喂常規飼料，其中高血糖組同時于腹腔內注射STZ 55mg/kg、其余三組腹腔內注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后高血糖組斷尾取血，測血糖＞16.7 mmol/L、尿糖3+～4+持續3 d視為高血糖造模成功。其后各組同前飼養，6周后各組禁食12 h、稱體質量，糖尿病組腹腔內注射STZ 30mg/kg，其余三組腹腔內注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后糖尿病組斷尾、取血，測血糖及尿糖達上述標準視為2型糖尿病造模成功［1］。各組均繼續飼養4周至第10周結束實驗。實驗過程中糖尿病組造模失敗2只、死亡1只，高血糖組造模全部成功、死亡4只。

1.3 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)等檢測上述實驗結束后，四組均禁食12 h、測體質量，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，并進行心臟采血，采用拜安捷快速血糖儀檢測FBG，用放射免疫法檢測FINS，按公式ln［1/(FPG×FINS)］計算胰島素敏感指數(ISI);采血結束后斷椎處死動物，快速取大鼠右后肢大腿肌肉組織，附睪周圍脂肪及腎周脂肪，稱脂肪質量后立即將標本置于液氮中，于-80℃保存。

1.4 骨骼肌及脂肪組織中GLUT4 mRNA表達測定①引物設計:GLUT4引物擴增產物片段長度為154 bp，內參照β-actin擴增產物片段長度為690 bp。②RNA提取及反轉錄:取骨骼肌組織、脂肪組織各100mg，應用RNA提取液提取總RNA。逆轉錄反應體系12 μl，條件為65 ℃1min，30 ℃5min，15～30min勻速升溫至65℃，65℃30min，98℃5min，5 ℃5min。③PCR 反應:反應體系25 μl，包括cDNA 3 μl、滅菌蒸餾水17.1 μl，10 × Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture 2 μl、Bca-Optimized Taq 0.2 μl、GLUT4或β-actin上下游各0.1 μl。反應條件:94℃預變性3min，94℃變性40 s(β-actin為30 s)，55.9 ℃退火1min，72 ℃延伸1min(β-actin為5min)，擴增35個循環。72℃延伸7min。④反應產物檢測與分析:PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，取PCR產物5 μl電泳30min，將凝膠放入G:Box Sygene PCR分析儀中拍照記錄結果，用激光密度掃描儀記錄GLUT4和β-actin電泳帶密度進行分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS11.5軟件進行統計學處理，計量數據以±s表示，非正態分布數據經對數轉換后進行分析，組間比較采用方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 FBG、FINS及 ISI 10周后四組FBG、FINS及ISI見表1。

表1 四組FBG、FINS及 ISI比較(±s)

表1 四組FBG、FINS及 ISI比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

ISI糖尿病組 10 9.39±1.86* 17.16±1.95* -5.08±0.12組別 n FBG(mmol/L) FINS(IU/L)*高脂組 10 5.95±0.81 24.92±1.13* -4.99±0.17*高血糖組 9 24.01±6.49* 3.01±1.34 -4.13±0.44照組10 5.02±0.67 7.66±0.75 -3.64±0.22對

2.2 骨骼肌和脂肪組織中GLUT4 mRNA表達 10周后四組骨骼肌和脂肪組織中GLUT4 mRNA表達見表2。

表2 四組GLUT4 mRNA表達比較(±s)

表2 四組GLUT4 mRNA表達比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與脂肪組織比較，△P＜0.01

骨骼肌 脂肪糖尿病組 10 1.62±0.33＊△0.84±0.14組別 n*1.40±0.24高脂組 10 1.70±0.25＊△0.93±0.21*高血糖組 9 1.40±0.49＊△0.71±0.15*對照組 10 2.61±0.60△

3 討論

葡萄糖是機體能量的主要來源，而GLUT4為最主要的葡萄糖運載體［2］，存在于胰島素敏感的骨骼肌、心肌、脂肪等細胞中。無胰島素刺激時GLUT4主要位于細胞儲存囊泡內;胰島素與受體結合后，可通過多種蛋白質與蛋白質間的相互作用［3］調控GLUT4轉運，此使胰島素敏感組織可迅速對循環胰島素水平作出反應、保持血糖平衡［4，5］，而GLUT4合成、分泌以及轉位等異常均可能導致2型糖尿病。胰島素抵抗是2型糖尿病重要發病機制之一。Carvalho等發現，在dB/dB小鼠模型中，過量表達GLUT4可改善糖尿病病情，而GLUT4遺傳缺陷者則表現為胰島素抵抗。目前研究認為，胰島素抵抗與組織中GLUT4內在活性降低、再分布(特別是胰島素刺激后細胞內膜向細胞膜轉位減少)、基因轉錄受抑導致GLUT4 mRNA和蛋白含量減少有關［4］。

本研究顯示，與對照組比較糖尿病組 FBG、FINS及ISI顯著升高、骨骼肌及脂肪組織中GLUT4 mRNA表達均明顯下調;高血糖組、高脂組骨骼肌和脂肪組織GLUT4 mRNA表達亦顯著低于對照組。進一步證實GLUT4 mRNA表達下降所致骨骼肌、脂肪組織對葡萄糖攝取利用減少是胰島素抵抗的重要分子基礎，是誘發2型糖尿病的原因之一;高脂和高血糖可能均為引起GLUT4 mRNA表達改變的主要因素。本研究還顯示，GLUT4 mRNA在骨骼肌中的表達顯著高于脂肪組織，與以往研究基本一致。文獻報道，高脂飲食可下調白色脂肪組織中GLUT4水平，并明顯減弱有胰島素刺激脂肪細胞的GLUT4轉位及葡萄糖攝取，此作用隨飲食中n-3多不飽和脂肪酸的增加而減弱;脂肪細胞GLUT4表達水平下降還可誘導肌肉、肝臟等組織的胰島素抵抗［6］;高血糖、高胰島素血癥可引起GLUT4基因轉錄功能障礙、GLUT4蛋白合成減少，導致肌細胞攝取和利用葡萄糖的能力下降［7］。

綜上所述，GLUT4 mRNA在骨骼肌中的表達高于脂肪組織;高脂、高血糖可通過下調GLUT4 mRNA表達加重胰島素抵抗，進而誘發2型糖尿病。

［1］司曉晨，尚文賓，卞慧敏，等.鏈脲佐菌素加高脂飲食誘導2型糖尿病大鼠模型［J］.安徽中醫臨床雜志，2003，15(5):383-385.

［2］遲鋮，金苗苗，母義明，等.糖尿病大鼠模型建立及其脂肪組織PPARγ和GLUT4表達的改變［J］.軍醫進修學院學報，2008，29(3):220-222.

［3］James DE.MUNC-ing around with insulin action［J］.J Clin invest，2005，155(2):219-221.

［4］Watson RT，Pessin J.Intracellular organization of insulin signaling and GLUT4 translocation［J］.Recent Prog Horm Res，2001，56(2):175-193.

［5］Mohammad A，Sharma V，Mcneill JH.Vanadium increases GLUT4 in diabetic rat skeletal muscle［J］.Mol Cell Biochem，2002，233(1):139-143.

［6］Abel ED，Peroni O，Kim JK，et al.Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver［J］.Nature，2001，409(6821):729-733.

［7］Chan P，Wong KL，Lin IM，et al.Antihyperglycemic action of angiotensin Ⅱ receptor antagonist valsartan，in streptozot-ocin-induced diabetic rats［J］.Hypertension，2003，21(4):761-769.