甘草飲片乙酸乙酯提取部位HPLC指紋圖譜研究

蘇本正， 周 倩， 孫立立*

(1.山東省中醫藥研究院，山東濟南 250014;2.山東中藥醫藥大學，山東濟南 250014)

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFischer.、脹果甘草Glycyrrhiza inflateBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根莖［1］。甘草為臨床常用中藥，是我國2000種草藥中用量最大的一味藥材［2］。臨床上以飲片入藥，常見的飲片規格為生品和炙品兩種。但是，中藥飲片的炮制缺乏標準操作規程的現象目前還相當突出［3-5］，需要建立完善的炮制標準來規范它。甘草生品具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調和藥性的功效，經蜜炙后增強了其補脾益氣的作用，以補脾和胃、益氣復脈為主［6-8］。中藥炮制后藥效改變的根本原因是炮制引起了中藥化學成分的變化，前期對甘草及蜜炙甘草的HPLC指紋圖譜研究［9］發現，炮制后化學成分的確發生了一定的變化。單獨的一兩個成分的測定，不能系統、完整地反映甘草的內在質量，目前指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥質量的有效手段［10-12］，為進一步追蹤變化成分所在部位，本實驗提取了甘草乙酸乙酯提取部位，對其進行了指紋圖譜研究，并對生、炙品進行了初步比較，從而為進一步明確藥效改變的物質基礎，解析甘草蜜炙原理提供依據和數據支持。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測器，1/10萬電子天平(Sartorius R200D，德國)。乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、醋酸均為分析純。甘草苷對照品(批號11610-200604)購自中國藥品生物制品檢定所。

甘草飲片:甘草01(產地內蒙古)、甘草02(內蒙古)、甘草03(甘肅)為自制甘草飲片，藥材購自山東天一中藥飲片有限公司，甘草04(新疆)為自制甘草飲片，藥材購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠;甘草05購自寧夏銀川，產地內蒙古;甘草06購自濟南建聯大藥房，產地內蒙古;甘草07購自南京金陵大藥房，產地甘肅;甘草08購自北京圣惠堂中藥飲片有限公司，產地內蒙古;甘草09購自濟南同仁堂藥店，產地內蒙古;甘草10購自山東天一中藥飲片有限公司，產地新疆。

炙甘草飲片:炙甘草01、炙甘草02、炙甘草03、炙甘草04分別為甘草01、02、03和04制得蜜炙甘草飲片。炙甘草05購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠，產地新疆;炙甘草06購自山東天一中藥飲片有限公司，產地新疆;炙甘草07購自濟南建聯大藥房，產地內蒙古;炙甘草08購自北京圣惠堂中藥飲片有限公司，產地內蒙古;炙甘草09購自濟南同仁堂藥店，產地內蒙古;炙甘草10購自南京金陵大藥房，產地甘肅。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件 Hyperclone ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-冰醋酸水溶液(0.2%);柱溫:30℃;流速:1 mL/min;檢測波長:310 nm。梯度條件見表1。

表1 梯度洗脫程序表Tab.1 Gradient elution

2.2 供試品溶液制備 取(炙)甘草粗粉10 g，加入10倍量水，回流提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，將濾液濃縮至10 mL，加入乙醇使含醇量達到80%，靜置24 h，濾過，濾液濃縮至無醇味，繼續濃縮至稠膏狀，加入適量水使溶解，轉移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液減壓回收乙酸乙酯至干，加適量甲醇使溶解，并定容至10 mL，混勻，精密吸取1 mL至25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對照品溶液制備 取甘草苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 對照試驗 取對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。見圖1。

圖1 甘草苷對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of glycyrrhizin

2.4.2 精密度試驗 取炙甘草02供試品溶液10 μL，連續進樣6次，以甘草苷的保留時間和峰面積為參照，分別對各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。結果表明:各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求。

2.4.3 穩定性試驗 取炙甘草02供試品溶液，在室溫下保存，分別于 0，3，6，9，12 h 測定，以甘草苷保留時間和峰面積為參照，分別對各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。結果表明，各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間基本一致，RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求。

2.4.4 重復性試驗 取炙甘草02飲片粗粉6份，按照供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，依次測定，以甘草苷保留時間和峰面積為參照，分別對各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。結果表明，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜要求。

2.5 炙甘草飲片乙酸乙酯部位指紋圖譜 取各炙甘草樣品，照2.2項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件依法進行測定，記錄HPLC色譜圖。以甘草苷為參照，對各主要色譜峰相對峰面積進行統計，結果見表2。

表2 10批炙甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜(相對峰面積)Tab.2 Relative peak area of HPLC fingerprint common peaks of honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

炙甘草乙酸乙酯部位共有峰的確定及指紋圖譜共有模式的建立 運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對10批炙甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜進行相似度分析，以S1為參照圖譜，經過多點校正、自動匹配，以中位數法，生成對照圖譜R，由匹配數據的輸出結果得到共有峰共8個，分別為3.85、11.77、12.21、25.45、26.49、28.67、31.82、48.25 min處色譜峰，其中12.21 min峰為甘草苷。除上述色譜峰，在11.01 min左右，除炙甘草02和10外有一共有峰，在34.7和42.70 min左右除炙甘草02和09外有一共有峰，44.496 min除了炙甘草01，02，03和炙甘草09外有一共有峰，56.72 min炙甘草04，05，06有一共有峰，58.63 min炙甘草05較其他甘草多一色譜峰。見圖2。

圖2 10批炙甘草飲片色譜疊加圖(R為對照圖譜)Fig.2 The overlapped chart for ten batches of honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(R is comparison chart)

指紋圖譜的相似度評價使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”進行相似度分析，結果見表3，經分析，10批次炙甘草飲片與相應對照圖譜的相似度均大于0.90，符合要求。

表3 與共有模式比較的蜜炙甘草相似度Tab.3 Results of similarity analysis of honey-fried Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

2.6 生甘草飲片乙酸乙酯部位指紋圖譜 取各生甘草樣品照2.2項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件依法進行測定，記錄HPLC色譜圖，以甘草苷為參照，對各主要色譜峰相對峰面積進行統計，結果見表4。

生甘草乙酸乙酯部位共有峰的確定及指紋圖譜共有模式的建立運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對10批生甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜進行相似度分析。以S1為參照圖譜，經過多點校正、自動匹配，以中位數法，生成對照圖譜R，由匹配數據的輸出結果得到共有峰共10個，分別為11.01、11.77、12.21、25.47、26.505、28.67、31.81、34.71、42.69、48.24 min。此外，在 17.89min 飲片01、02、06、08、09 有峰，43.97 min 飲片 05 有峰，在44.49 min飲片04、05和10有峰，52.68和56.74 min飲片04和10有峰，58.66 min飲片04有峰。見圖3。

表4 10批甘草乙酸乙酯部位指紋圖譜相對峰面積Tab.4 Relative peak area of HPLC fingerprint common peaks of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

圖3 10批生甘草飲片指紋圖譜(R為對照圖譜)Fig.3 The overlapped chart for ten batches of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(R is comparison chart)

指紋圖譜的相似度評價使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”進行相似度分析，結果見表5，經分析，10批次生甘草飲片與相應對照圖譜的相似度均大于0.90，符合要求。

2.7 生炙飲片乙酸乙酯部位比較 炙甘草01、02、03和04分別由甘草01、02、03和04制得，分別對01，02，03和04甘草炮制前后峰面積進行了統計，比較甘草乙酸乙酯提取部位炮制前后的變化情況，結果見表5。

表5 與共有模式比較的生甘草相似度Tab.5 Results of similarity analysis of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

由表5可見，在四產地甘草共有峰中，10.99、11.74、12.19、25.34、26.42、28.53、34.63、42.67、48.22 min色譜峰經蜜炙后峰面積減小，3.85 min色譜峰經蜜炙后峰面積增加，其余各色譜峰，4.86 min和7.67 min(甘草04無)色譜峰經蜜炙后峰面積增加，10.62 min色譜峰(甘草01和04無)，17.89 min(甘草03和04無)、53.53 min(甘草04無)色譜峰經蜜炙后峰面積減小，另甘草04在44.44、52.68、56.74和58.66 min較其他甘草多一色譜峰，峰面積經蜜炙后減小。31.73 min色譜峰炙甘草01和03峰面積略有增加，但與生品相比差異較小，炙甘草02和04峰面積減少，考慮炮制對其影響較小或為積分誤差所致。

表5 生炙甘草乙酸乙酯提取部位主要色譜峰峰面積比較Tab.5 Comparison of chemical constituents between Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and processed products

3 結論

本實驗通過研究建立了甘草飲片乙酸乙酯提取部位的指紋圖譜，得到指紋圖譜各色譜峰分離度較好，基線平穩，色譜信息較為豐富，而且色譜峰分布均勻，參照峰甘草苷(保留時間12.2 min)與其他色譜峰分離度良好。

通過測定，不同產地甘草飲片與生成的對照圖譜比較相似度良好，均大于0.90。各主要色譜峰相對保留時間基本一致，符合指紋圖譜的要求。但所含成分有所差異，且峰面積差別較大，說明產地不同其成分之間會有一定的差異。

通過對生炙甘草比較發現，甘草與炙甘草乙酸乙酯部位的化學成分有所不同，各成分的含量比例關系發生了變化，且有新的化學成分產生。11 min之前的色譜峰蜜炙后峰面積普遍增大，11 min之后色譜峰峰面積經蜜炙后降低，說明蜜炙使極性較大成分含量增加，極性較小的成分含量降低。該變化可能為甘草藥效作用改變的物質基礎。要想明確甘草蜜炙炮制原理，還需進一步對其他提取部位進行分析，同時分離炮制前后變化明顯的化學成分，對其進行生理活性篩選，尋找炙甘草藥理活性成分，從而為炙甘草炮制工藝和質量標準提供有效的質控指標，全面提高飲片質量，以保證中醫臨床用藥的安全性和有效性提供依據。

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