蝎素組分Ⅲ對 Jurkat細胞NF-кB通路的調節作用

趙永新， 宋向鳳， 郭繼強， 王 輝

(新鄉醫學院免疫學研究中心，河南新鄉 453003)

蝎毒在中醫治療上，鎮痛、抗驚厥、免疫調節、抗腫瘤等方面的實踐已取得了很好的效果［1］。其中起主要藥理作用的蝎毒組分Ⅲ是從河南馬氏鉗蝎毒中分離出的一種成分，對多種腫瘤細胞及細胞系有顯著的細胞殺傷和細胞毒性作用［2－3］。研究資料表明蝎素具備細胞毒性作用的同時，還有重要的生物應答調節劑的作用，可顯著增強小鼠的免疫功能，促進T淋巴細胞的轉化和 TNF－a的分泌，使用藥量顯著減少并可增強其它抗腫瘤藥物的效應。但關于蝎素對細胞免疫調節影響研究較少，SCVⅢ對T淋巴細胞免疫調節的機制尚不清楚。本研究以Jurkat細胞作為研究對象，觀察 SVCⅢ對Jurkat細胞IKK1、IкBa mRNA表達的影響，以及對 Jurkat細胞中 NF－кB活化的影響，并探討SVCⅢ參與細胞免疫調控的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 T淋巴細胞系Jurkat購自美國ATCC公司，TfxTM－50質粒由美國NIH欒好江博士惠贈。轉染試劑TfxTM－50 Reagent、逆轉錄酶MMLV購自Promega公司產品，總RNA抽提試劑盒Rneasy Mini kit購自QIAGEN公司 ，SVC－Ⅲ由新鄉醫學院分析測試研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Jurkat細胞復蘇后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基進行培養，細胞呈懸浮生長，聚集成團狀為生長良好，每2～3 d換1次培養液。

1.2.2 瞬時轉染與熒光素酶相對活性測定 按照TfxTM－50 Reagent(Promega)產品說明書進行操作。將質粒 NF－кB－Luc 和內對照 β－Gal轉染 Jurkat細胞，轉染5 h后加入終濃度為0、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10 ng/mL和 100 ng/mL的 SVC－Ⅲ。48 h后將細胞收集于1.5 ml EP管，用0.01 mol/L pH7.2的PBS洗2次，加入200 μL裂解液，室溫放置15 min，渦旋振蕩混勻，12 000 r/min 4℃ 離心10 min，收取20 μL上清細胞裂解液放置于測定管中，加入100 μL熒光素酶反應底物，在熒光分析儀上測定熒光強度，檢測時間為20 s。實驗重復3次。

1.2.3 RT－PCR擴增IKK1、IкBa 將生長狀態良好的Jurkat細胞離心收集，調整細胞濃度為5×106個/mL，分裝于24孔培養板中，1 mL/孔，加入到終濃度為 0、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、10 ng/mL 和 100 ng/mL的SVC－Ⅲ。48 h后用QIAGEN總RNA抽提試劑盒提取Jurkat細胞總RNA，按說明進行操作。擴增所用基因引物:IKK1:上游:5′－GCAGAGAGGAGGACCTGTTG－3′，下游:5′－ACTGCTTCAGCCCACACTTT－3′，擴增產物為 438 bp;IкBa:上游:5′－AACCTGCAGCAGACTCCACT－3′，下 游:5′－ACACCAGGTCAGGATTTTGC－3′，擴增產物為 376bp;內參GAPDH:上游:5′－TTAGCACCCCTGGCCAAGG－3′，下游:5′－CTTACTCCTTGGAGGCCATG－3′，擴增產物為550bp。PCR反應條件為:95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30，循環36次，最后在72℃延伸5 min。同管在擴增到 24、28、32、36 循環時，分別取10 μL備用。取5 μL擴增產物電泳，用凝膠成像系統掃描。實驗重復3次。

2 結果

2.1 NF－κB熒光素酶報告基因轉染實驗結果SVCⅢ濃度的逐漸增加(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)對Jurkat細胞 NF－κB的作用逐漸增強。濃度增加到1.0 ng/mL時，SVCⅢ對NF－κB的作用最強。隨著SVCⅢ濃度的增加到一定濃度(10 ng/mL、100 ng/mL)，SVCⅢ對 Jurkat細胞 NF－κB 的作用減弱。

2.2 Jurkat細胞株中IKK1和IкBa mRNA的檢測SVC－Ⅲ濃度的逐漸增加(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)對Jurkat細胞的IKK1和IкBa的表達作用逐漸增強。濃度增加到1.0 ng/mL時，SVCⅢ對IKK1和IкBa的mRNA的表達作用最強。隨著SVCⅢ濃度的增加到一定濃度(10 ng/mL、100 ng/mL)，SVCⅢ對Jurkat細胞IKK1和IкBa的表達作用減弱。各組中隨著循環的增加 IKK1、IкBa的mRNA表達是逐漸增強的。無SVCⅢ刺激，IкBa的表達強于IKK1;SVCⅢ(0.1、1.0、10、100 ng/mL)刺激組，IKK1 的表達強于 IкBa。見圖 1 ～2。

圖1 NF-κB熒光素酶報告基因轉染實驗結果Fig.1 NF-κB fluorescent element enzyme gene transfection experimental results

圖2 不同濃度SVCⅢ刺激Jurkat細胞 IKK1、IкBa和GAPDH在24、28、32和36循環mRNA的表達Fig.2 The expression of different concentration SVCⅢstimulate IKK1，IкBa and GAPDH of 24，28，32 and 36 mRNA cycle in Jurkat cell

3 討論

近年來，蝎素作為生物應答調節劑調節免疫系統功能的研究已引起廣泛重視，我們以前的研究顯示SVCⅢ能夠促進T淋巴細胞的轉化和腫瘤壞死因子的分泌［4］，能以劑量依賴的方式調節Jurkat細胞中信號分子ZAP－70和LAT的表達［5］。蝎毒多肽提取物可以改善荷瘤機體細胞免疫功能的抑制狀態，增強其識別、殺傷突變細胞的能力，發揮抗腫瘤作用，腫瘤抑制率可達 55.21%［3］。

關于蝎素對細胞免疫功能的影響研究較少，SVC－Ⅲ對T淋巴細胞免疫功能的機制尚不完全清楚。Jurkat E6－1細胞是人類T淋巴腫瘤細胞的細胞株，在功能上與人類 T淋巴細胞有很多共同的特點，T淋巴瘤的激活與凋亡有很多種因素，在免疫調節中具有十分重要的作用機制，已廣泛用于實驗室研究。本研究以Jurkat E6－1細胞作為研究對象，觀察不同濃度的SVC－Ⅲ對Jurkat細胞NF－кB信號通路的影響，以探討SVC－Ⅲ抗腫瘤的作用，為抗腫瘤治療尋求更加有效的方法。并探討SVC－Ⅲ參與細胞免疫調控的可能機制。

本研究發現低劑量 SVC－Ⅲ(0.1 ng/mL、1.0 ng/mL)對Jurkat細胞 NF－кB活性及調空蛋白 IкBa及相關激酶IKK1mRNA的表達有一定促進作用，特別是在濃度為1.0 ng/mL時作用最強(P＜0.01)，而隨著濃度增高作用開始逐漸減弱。NF－кB是一種細胞核轉錄因子，在調控免疫細胞的激活、淋巴細胞的發育、細胞凋亡、腫瘤形成、病毒復制、炎癥反應及多種自身免疫性疾病方面發揮重要作用［6－8］。正常情況下NF－κB與NF－κB的內源性抑制因子主要是IκB抑制蛋白結合，以失活的形式存在胞漿中，當細胞接受刺激，IκB裂解，暴露出 NF－κB亞基上核定位序列和具有基因轉錄活性的反式激活域，NF－κB從胞漿移位入胞核，發揮基因轉錄調控的作用。IкBa 是細胞內 NF－κB 的主要抑制因子，細胞內 IкBa的水平、IкBa受信號刺激后能否正常磷酸化進而降解對 NF－κB 活化起關鍵作用［9－10］，而 IкBa 的磷酸化受IκB激酶(IKK)的調節。IKK1可使 NF－кB抑制蛋白IкB被磷酸化，通過泛素降解途徑使 IкB由NF－кB 二聚體上解聚，從而激活了 NF－кB，進而調控靶基因的轉錄。一些體內外的實驗研究表明，NF－кB在乳腺癌中異常激活，抑制乳腺癌細胞NF－кB的活性可引起腫瘤細胞的凋亡，從而抑制乳腺癌細胞生長［11］。從本實驗中可以看出高劑量的可以通過IKK1 抑制 IкBa 的磷酸化，IкBa 不能從 NF－кB 二聚體上解聚，NF－κB未能被激活，不能調控靶基因的轉錄。SVC－Ⅲ通過抑制NF－кB活性的作用，可以阻斷NF－κB信號通路抑制細胞增殖，使腫瘤細胞的生長受到抑制。

以上研究結果表明高濃度SVC－Ⅲ可抑制Jurkat細胞IкBa蛋白的磷酸化，抑制NF－κB途徑的激活，從而阻斷NF－κB 信號通路IKK1、IкBa表達，進而誘導細胞周期阻滯、抑制腫瘤細胞增殖。可見對NF－κB的深入研究為抗腫瘤治療提供了新的、更為有效的作用靶點，為臨床癌癥病人的治療提供了一種有效的治療手段。

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