丹皮酚脂質體的研制及其體外釋放研究

賈獻慧， 唐文照， 閆 軍

(1.山東省醫學科學院藥物研究所，山東省現代醫用藥物與技術重點實驗室，山東濟南 250062;2.濟南市皮膚病防治院，山東濟南 250001)

丹皮酚(paeonol)是中藥牡丹皮的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗變態反應、免疫調節、鎮痛等［1－4］藥理作用，現已廣泛用于常見皮膚病治療，能抑制黑色素細胞內酪氨酸酶的活性及黑色素的生成，對色斑、皮膚瘙癢、牛皮癬、帶狀皰疹、濕疹等具有較好的治療作用［4－5］。已知劑型主要有軟膏劑、貼劑、注射劑等。丹皮酚在水中的溶解度很低且易升華，見光易氧化分解，影響其使用和療效。我們將其制成脂質體凝膠，局部涂抹治療皮炎、濕疹等，是種新劑型。制成脂質體凝膠，因脂質體優良的生物相容性可將不易溶于水的藥物包裹于其中，攜帶進入皮膚，增加透皮效果，并能提高藥物的穩定性，增強療效［6］。

本實驗主要對丹皮酚脂質體進行研究，對丹皮酚脂質體不同制備方法進行了考察，篩選出了合適的制備方法，并對制備的的丹皮酚脂質體進行了相關研究。

1 試驗材料

1.1 藥品與試劑 丹皮酚(泰安中薈植物生化有限公司);大豆卵磷脂(上海楷洋生物技術有限公司);膽固醇(中國醫藥集團上海化劑公司);維生素E(山東省醫科院藥物所仲浩惠贈);丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所);魚精蛋白(上海第一生化藥業有限公司);CE型高精度透析袋(上海綠鳥科技發展有限公司);MeOH、CH2Cl2為分析純;蒸餾水為新鮮自制。

1.2 儀器 AG245型電子天平(瑞士Mettler Toledu公司);R200真空旋轉蒸發儀(瑞士BüCHI公司);U－3000型紫外－可見分光光度計(日本 HITACHI公司);LDZ5－2型臺式低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠);85－2型磁力加熱攪拌器(金壇市江南儀器廠);ZETASIZER3000粒度分布與電勢分析儀(英國Malvern公司);JEM－1200EX透射電鏡(日本電子);ZRS－8G型智能溶出試驗儀(天津大學無線電廠)。

2 試驗方法

2.1 應用不同制備工藝制備丹皮酚脂質體［7－10］

2.1.1 薄膜－超聲法 分別按處方量稱取丹皮酚、大豆卵磷脂、膽固醇及維生素E，加入CH2Cl2溶解，置旋轉蒸發儀上40℃減壓干燥成膜。加pH 6.5磷酸鹽緩沖液，振搖并超聲使之分散均勻，依次過0.80、0.45 μm微孔濾膜各3次進行整粒，即得。

2.1.2 乙醇注入法 分別按處方量稱取丹皮酚等脂質，加入無水乙醇超聲使溶解，得到混懸液。取pH 6.5的磷酸鹽緩沖液10 mL置三角燒瓶中，加入磁子，密封，置磁力加熱攪拌器上攪拌，設定溫度為40℃，將脂質的乙醇混懸液通過一注射針頭，快速注入緩沖液中，得到懸浮液，將其依次過0.80、0.45 μm微孔濾膜進行整粒，即得。

2.1.3 乙醚注入法 分別按處方量稱取丹皮酚等脂質，加入乙醚溶解。取pH 6.5的磷酸鹽緩沖液置燒杯中，加入磁子，置磁力加熱攪拌器上攪拌，設定溫度為40℃，將脂質的乙醚溶液通過一注射針頭，緩緩注入緩沖液中，得到懸浮液，將其依次過0.80、0.45 μm微孔濾膜進行整粒，即得。

2.1.4 逆相蒸發法 分別按處方量稱取丹皮酚等脂質，加入CH2Cl2溶解后，加入pH6.5的磷酸鹽緩沖液，振搖并超聲使之分散成W/O型乳劑，置旋轉蒸發儀上40℃減壓蒸發除去溶劑，到達膠態后，再加pH6.5磷酸鹽緩沖液，旋轉蒸發使器壁上的凝膠脫落，繼續減壓蒸發得到混懸液，將其依次過0.80、0.45 μm微孔濾膜進行整粒，即得。

2.1.5 二次乳化法 分別按處方量稱取丹皮酚等脂質，加入CH2Cl2溶解后，加入pH 6.5的磷酸鹽緩沖液，振搖并超聲使之分散成W/O型乳劑，再加pH 6.5的磷酸鹽緩沖液，振搖并超聲使之分散成W/O/W型乳劑，置旋轉蒸發儀上40℃減壓蒸去溶劑，得混懸液，將其依次過0.80、0.45 μm微孔濾膜進行整粒。

2.2 對各脂質體進行質量考察

2.2.1 脂質體微觀形態觀察 取各脂質體適量，分別用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液稀釋后，滴加在有支持膜的專用銅網上，用3%磷鎢酸鈉溶液染色后，自然晾干，在透射電鏡下觀察脂質體的形態。

2.2.2 脂質體粒度分布 取各脂質體適量，分別用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液稀釋后，用ZETASIZER3000粒度分析儀進行測定，應用動態光散射軟件進行數據處理，記錄平均粒徑及多分散性指數。

2.2.3 包封率的測定 采用魚精蛋白法考察脂質體包封率。

丹皮酚含量測定采用紫外－可見分光光度法［11］。取丹皮酚對照品5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容。分別從中精密量取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL 分別置 25 mL 量瓶中，定容，在274 nm處測定吸光度，繪制工作曲線，考察線性關系。

取脂質體混懸液搖勻，精密量取0.1 mL，分別置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，測定脂質體中總藥物的濃度。

取脂質體混懸液搖勻，精密量取0.1 mL，分別置于10 mL錐形離心管中，加入0.1 mL魚精蛋白溶液(10 mg/mL)，攪勻，靜置3 min，再加3 mL生理鹽水，在室溫條件下2 000 g離心20 min。吸取2 mL上清液，測定游離藥物的濃度。

以甲醇為空白，分別取丹皮酚脂質體各樣品溶液，在274 nm處測定吸收度，并計算各制備工藝脂質體的包封率(Qw%)。

綜合各脂質體的特性和包封率，確定合適的制備工藝制備丹皮酚脂質體。

2.3 丹皮酚脂質體的制備及質量考察 按優選的制備工藝制備丹皮酚脂質體，進行形態觀察、粒徑測定并測定其包封率。

2.4 丹皮酚脂質體體外釋放研究［12］

丹皮酚混懸液的制備:精密稱取丹皮酚細粉(過100目)40 mg，加pH 6.5磷酸鹽緩沖液10 mL，超聲使成混懸液，即得。

精密量取丹皮酚脂質體及丹皮酚混懸液各3份，每份0.1 mL，分別加甲醇至5 mL，振搖使溶解;再分別從中精密取出0.5 mL，加甲醇至5 mL。以甲醇為空白，在274 nm處測定吸光度，計算藥物含量。

精密量取丹皮酚脂質體及丹皮酚混懸液各3份，每份0.5 mL，分別置于面積同樣大小的高密度透析袋中，固定于溶出儀的攪拌漿上，pH 6.5磷酸鹽緩沖液200 mL為釋放介質，37℃，100 r/m條件下進行釋放試驗，丹皮酚混懸液及其脂質體分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 時取樣，每次精密取樣5.0 mL，同時補加同體積同溫度的新鮮介質。將取出的樣品溶液經0.8 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

取體外釋放試驗所得的樣品溶液，以甲醇為空白，在274 nm處測定吸光度。計算各樣品溶液中所含藥物總量及釋放度。

3 試驗結果

3.1 不同制備工藝的脂質體質量考察

3.1.1 脂質體微觀形態觀察 由透射電鏡照片可以看出，乙醚注入法制得的脂質體粒徑差異較大，其余制備工藝所制的脂質體大多為粒徑均一的圓球形結構，見圖1。

圖1 不同制備方法所得丹皮酚脂質體電鏡圖

3.1.2 脂質體粒度分布 各脂質體平均粒徑及多分散性指數見表1。

表1 不同制備工藝制得的脂質體粒徑分析(n=3)

3.1.3 包封率的測定 丹皮酚溶液在2.14～12.84 μg/mL內，濃度與吸收度有著良好的線性關系，回歸方程為y=0.097 7x－0.002 5，r=0.999 7。各制備工藝脂質體的包封率測定結果見表2。

結果表明，薄膜－超聲法、逆相蒸發法、二次乳化法制備的脂質體包封率較高。考慮到薄膜－超聲法制備的脂質體形狀較為圓整、大小均勻，粒徑分布較為合理，包封率較高，且操作較為簡單方便，決定選用薄膜－超聲法來制備丹皮酚脂質體。

表2不同制備工藝制備的丹皮酚脂質體包封率(n=3)

3.2 丹皮酚脂質體的的制備及質量考察

采用薄膜－超聲法制備得到丹皮酚脂質體，并進行質量考察。

脂質體混懸液呈乳白色，分散較好。由透射電鏡照片可以看出脂質體大多為粒徑均一的圓球形結構，見圖2;其平均粒徑為359.3 nm，多分散性系數為0.435 7;丹皮酚脂質體包封率為71.55%。

圖2 丹皮酚脂質體電鏡圖(×10，000)

3.3 丹皮酚脂質體的體外釋放

丹皮酚脂質體釋放曲線見圖3:

圖3 丹皮酚脂質體和混懸液釋放曲線(n=3)

可以看出，混懸液在1h時釋放即接近50%，而脂質體只有20%左右的釋放，脂質體明顯具有緩釋作用。兩者在12 h時釋放均達到90%左右。

4 討論

包封率是衡量脂質體質量的一個重要指標，所以本文以包封率為主要指標來衡量不同的制備工藝。魚精蛋白凝聚法是一種適應性較廣的包封率測定方法，預試驗時曾采用葡聚糖凝膠柱層析法來測定脂質體的包封率，比較繁瑣、費時，后來選擇魚精蛋白法，簡便快速，且重現性好。

應用薄膜－超聲法制備丹皮酚脂質體，經查閱文獻及預試驗，曾以包封率為指標，對處方中大豆卵磷脂/膽固醇、大豆卵磷脂/丹皮酚以及維生素E用量進行了優選，得到最佳配比為大豆卵磷脂/膽固醇4∶1、大豆卵磷脂/丹皮酚10∶1、VE用量為0.1%。

報道，同時考慮到脂質體的體外釋放過程比較繁瑣且樣品較多，故選用紫外－可見分光光度法來測定丹皮酚的含量，方法簡單、方便、省時。

因磷脂結構中含有不飽和基團可以自發發生氧化，所以在脂質體處方中加入一定量的抗氧劑可以抑制自由基反應。考慮到VE除抗氧化外，還具有美白、抗衰老等功效，而我們的最終制劑是皮膚外用藥，所以選擇VE作為抗氧劑來抑制脂質體中磷脂等的氧化。在脂質體凝膠中則選擇尼泊金乙酯作為抑菌劑，結果表明抑菌效果良好，脂質體凝膠放置半年后，無變質、變色、腐敗等，穩定性良好。

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