大孔吸附樹脂純化芪丹冠心舒微丸提取物工藝研究

張永太， 馮年平， 趙繼會， 修彥鳳， 陶建生

(上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203)

芪丹冠心舒微丸為我校與企業合作開發的六類中藥新藥，原方中黃芪、丹參、三七三味藥材經醫用酒精提取，所得提取物得膏率較高，有必要對其進行進一步的純化研究。目前，大孔吸附樹脂已廣泛應用于食品及醫藥工業，在中藥有效物質的分離純化中也有較多應用。本研究即采用大孔樹脂，對提取物中有效組分進行分離純化工藝研究，進一步減小得膏率，富集有效成分，為后續制劑研究擴展空間［1－3］。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(美國Agilent公司，1100型);紫外可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司，UV754N型);電子天平(德國 SARTORIUS，BP211D型)。

實驗所用色譜純化學試劑與分析純化學試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司，95%醫用酒精購自上海中醫藥大學設備處，大孔樹脂購自上海摩速科學器材有限公司。

化學對照品購自上海市藥品檢驗所，均為中國藥品生物制品檢定所提供，分別為:丹酚酸B(批號:20070212);黃芪甲苷(批號:20070417);三七皂苷R1(批號:20070509);人參皂苷 Rb1(批號:20070417);人參皂苷Rg1(批號:20070417)。

實驗用藥材，黃芪(上海養和堂中藥飲片有限公司，批號:20061019)、丹參(上海康橋藥業有限公司，批號:20071226)、三七 (上海養和堂中藥飲片有限公司，批號:20070403)，經我校生藥學教研室專家鑒定，均為2010版《中國藥典》收載品種［4］。

2 實驗內容

2.1 指標性成分檢測方法

2.1.1 紫外—可見分光光度法測定總皂苷的含量［5－6］

因黃芪為本復方中君藥，用量大，故考慮以黃芪中所含的黃芪甲苷作為指標性成分，考察最大吸收波長。取精制的提取物總皂苷，配成濃度為0.5 mg/mL的溶液。精密吸取0.2 mL，加入香草醛溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，于60℃水浴中放置15 min后，放入冰水浴中冷卻2 min，然后加冰醋酸5 mL，進行全波長掃描，其吸收在530～550 nm處達到最大。文獻查閱得知黃芪甲苷、三七皂苷類成分的最大吸收波長也在此范圍，綜合以上因素，決定以530 nm作為本研究測定總皂苷的吸收波長。

取黃芪甲苷對照品10mg，精密稱定(10.08 mg)，置10 mL量瓶中，加無水乙醇使溶解并定容。分別精密移取黃芪甲苷標準溶液0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，精密加入香草醛溶液 0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，于60℃水浴中放置15 min后，放入冰水浴中冷卻2 min，然后加冰醋酸5 mL。以蒸餾水作為黃芪甲苷標準溶液，同法制備空白對照液，以黃芪甲苷含量對吸光度做直線回歸，得回歸曲線方程為Y=0.819 1X－0.044 3，相關系數r=0.999，即在黃芪甲苷量為0.075～0.76 mg范圍內，黃芪甲苷量與吸光度有良好的線性關系。

2.1.2 高效液相色譜法測定丹酚酸B的含量

采用C18ODS液相色譜柱，以甲醇－乙腈－甲酸－水(30∶10∶1∶59，v/v/v/v)為流動相，流速(1 mL/min)，檢測波長為286 nm，柱溫30℃。

取丹酚酸對照品，精密稱定，以甲醇溶解并定容，制備成0.3(mg/mL)濃度溶液。分別精密移取0.25、0.50、1.00、1.50、2.50、3.75 mL，分別置 5 mL量瓶中，甲醇定容。以濃度對峰面積回歸，直線方程為Y=10－4X－0.003 9，相關系數R=0.999，表明在濃度為0.015～0.300 mg/mL濃度范圍內，樣品濃度與峰面積有良好的線性關系。

2.2 樹脂型號考察 分別取 HPD100、HPD300、D101、D201、AB－8 樹脂［7－11］各 20 g，預處理后，每種型號樹脂平分成2份，即每份10 g，各加入20 mL藥液，于振動床(20℃，80 Hz)中振搖2 h，置冰箱中4℃放置12 h，取出裝柱，擠干藥液，收集藥液，用蒸餾水洗脫4次，每次50 mL。分別檢測原藥液、殘留液和蒸餾水洗脫液中總皂苷、丹酚酸B的含量，計算比上柱量與比吸附量，結果見表1。

表1 樹脂型號考察

綜合比較各樹脂的比上柱量和比吸附量，可知除D201型樹脂外，其余4種樹脂的比上柱量與比吸附量均較高，4種樹脂的比上柱量與比吸附量差異較小。雖HPD100型大孔樹脂的比上柱量與比吸附量均為最高，但考慮目前醫藥與食品工業中對AB－8和D101兩種型號的樹脂應用最普遍，決定選用D101型大孔樹脂。

2.3 樹脂上樣方式考察［12］以比上柱量、比吸附量為考察指標，對動態上樣與靜態吸附兩種上樣方法進行比較。計算結果見表2。

表2 樹脂上樣方式考察

由以上數據分析可知，動態上樣總皂苷的比上柱量與比吸附量均高于靜態上樣，丹酚酸B的比上柱量高于靜態上樣，比吸附量二者相當。綜合以上考察結果，可以得出動態上樣為最佳上樣方式。

2.4 樹脂上樣工藝優化 以比上柱量、比吸附量為考察指標，對上樣樹脂柱的徑高比、上樣濃度、上樣次數進行正交考察，以確定最佳上樣工藝。稱取D101大孔樹脂各10 g，照前法預處理。按L9(3)4表，分別用0.5、0.25、0.125 g生藥/mL的藥液上樣，用蒸餾水洗脫4次，每次50 mL。見表3。

表3 因素水平

分別計算各次實驗中總皂苷與丹酚酸B的比上柱量與比吸附量，進行分析。結果見表4與表5。

表4 樹脂上樣工藝正交優化—總皂苷、丹酚酸B比上柱量與比吸附量綜合評分計算結果

由方差分析可得出，因素A對實驗結果具有極顯著性影響，而因素B和C對實驗結果影響均不顯著。綜合正交分析結果，若以總皂苷與丹酚酸B為考察指標，則最佳上樣工藝為A3B2C2，即上樣液濃度為0.125(g/mL)，柱徑高比為3.64(mm/cm)，上樣次數為8次。驗證試驗表明，優選出的工藝可靠。2.5 洗脫工藝優化 采用L9(3)4正交試驗，選擇乙醇濃度、乙醇用量與洗脫流速為考察因素，以洗脫百分率與洗脫純度為考察指標，優化洗脫工藝［13－14］。見表 6 與表 7。

表5樹脂上樣工藝正交優化—總皂苷與丹酚酸B方差分析

表6 因素水平

分別計算各次實驗中總皂苷與丹酚酸B的洗脫百分率與洗脫純度，分別進行直觀分析。結果見表7。

由直觀分析可得出，以總皂苷為指標性成分所得最佳洗脫工藝為:以60%濃度乙醇16倍量(倍樹脂重，w/w)進行洗脫，流速為0.2倍量(倍樹脂重，w/w)/min;以丹酚酸B為指標性成分所得最佳洗脫工藝為:以80%濃度乙醇16倍量(倍樹脂重，w/w)進行洗脫，流速為0.2倍量(倍樹脂重，w/w)/min。以丹酚酸B和總皂苷作為指標性成分，優化出的最佳洗脫工藝均為乙醇16倍量(倍樹脂重，w/w)進行洗脫，流速為0.2倍量(倍樹脂重，w/w)/min。因60%乙醇與80%乙醇洗脫丹酚酸B成分的效果相差不大，從節省溶劑成本的角度，宜選用60%濃度的乙醇作為洗脫溶劑。驗證試驗表明，優選出的工藝可靠。

表7 洗脫條件正交優化—總皂苷與丹酚酸B洗脫百分率與洗脫純度綜合評分計算結果

中試研究結果顯示，經過大孔樹脂純化后，所得干浸膏量由原來的60%(干浸膏/藥材，w/w)下降到20%，各指標性成分的轉移率均在80%以上，達到了預期目的。

3 小結

3.1 對上樣方式的考察結果顯示，動態吸附效果優于靜態吸附。目前生產中多采用靜態上樣作為上樣方法［15］，主要因為其操作比較方便。但經考察發現，本實驗中靜態上樣與動態上樣相比，比上柱量與比吸附量均明顯小于后者，兼考慮到動態上樣雖需在洗脫柱中完成，但其耗時短，無須振蕩，且上樣后可直接進行后續實驗的處理，因此最終確定動態上樣方式。

3.2 在對上樣方式的考察中，確定在2 h內完成，主要是考慮工作效率和體現動態上樣之于靜態上樣在效率方面的優越性。結果顯示，在2 h內動態上樣8次則可保證達到最佳吸附效果。

3.3 洗脫工藝的考察中，首先對洗脫溶媒進行單因素考察，制備了洗脫曲線，為采用正交試驗考察洗脫工藝中選取因素水平提供參考。實驗結果顯示，總皂苷與丹酚酸B在乙醇濃度為60%時均可達到較好的解吸效果，且所得固形物中以上兩種成分純度較高。

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